Domínio catalítico da enzima fosfodiesterase 5 humana : síntese da região codificante, clonagem, expressão e purificação

• Ano de defesa: 2008
• Autor(a) principal: Selbach, Bruna Pelegrim
• Orientador(a): Santos, Diógenes Santiago
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul
• Programa de Pós-Graduação: Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
• Departamento: Faculdade de Biociências
• País: BR
• Palavras-chave em Português: BIOLOGIA CELULAR; BIOLOGIA MOLECULAR; BIOMEDICINA; IMPOTÊNCIA - TRATAMENTO; DIESTER FOSFÓRICO HIDROLASES; REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE
• Área do conhecimento CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
• Link de acesso: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5315

Fosfodiesterase (PDE) é uma super família de enzimas responsáveis pela degradação dos segundos mensageiros intracelulares adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosina monofosfato cíclico (GMPc). Como reguladoras essenciais na sinalização de segundos mensageiros cíclicos com diversas funções fisiológicas as PDEs são alvo de drogas para o tratamento de diversas doenças. Dentre estas estão insuficiência cardíaca, depressão, asma, inflamação e disfunção erétil. Dentre as 11 famílias de genes de PDE, a fosfodiesterase 5 (PDE5) é específica para GMPc, sendo responsável pela atividade de hidrólise que sofre o GMPc dentro dos tecidos dos corpos cavernosos penianos dos homens. A PDE5 é amplamente conhecida por ser alvo de diversas drogas utilizadas no tratamento da disfunção erétil, como por exemplo, o sildenafil (Viagra®). Este trabalho tem por objetivo a síntese da região codificante, clonagem, expressão e purificação do domínio catalítico da PDE5 humana. A síntese da região codificante do polipeptídeo alvo foi realizada através da técnica de overlap, utilizando 24 oligonucleotídeos que foram unidos através da reação em cadeia da polimerase (PCR). A construção foi clonada em vetor pCRBlunt® e sequenciada para confirmar sua identidade e a ausência de mutações. O fragmento foi subclonado em vetor de expressão pET23a(+) com sítios de restrição NdeI e BamHI, para o N terminal e C terminal, respectivamente. Células eletrocompetentes de E. coli Rosetta (DE3) foram transformadas com o plasmídeo recombinante, a região que codifica para o domínio catalítico da PDE5 foi expressa em sua forma solúvel e ativa na presença de 0,1 mM do indutor IPTG. Quando o domínio catalítico da PDE5 foi isolado, um rendimento de 2,39 mg.mL-1 foi obtido através de 3 passos de purificação. O domínio catalítico da PDE5 puro permitirá a realização de uma triagem de extratos vegetais oriundos da biodiversidade brasileira. Com o intuito de buscar novos compostos que possam se tornar possíveis inibidores de PDE5, e assim serem utilizados no tratamento da disfunção erétil.