Diferenciação de células T reguladoras tímicas em camundongos geneticamente mutantes em WASp

• Ano de defesa: 2020
• Autor(a) principal: Fontes, Larissa Vasconcelos
• Orientador(a): Almeida, Vinícius Cotta de, Bonomo, Adriana César
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/43264

A proteína da síndrome de Wiskott-Aldrich (WASp) regula a dinâmica de rearranjos do citoesqueleto de actina e a função das células hematopoiéticas. Mutações no gene WAS levam a duas síndromes de imunodeficiência diferentes: a Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS), causada por mutações de perda de função na WASp, e a neutropenia ligada ao X (XLN), causada por mutações de ganho de função. Foi demonstrado que os pacientes com WAS e XLN carregam várias anormalidades nas atividades linfocitárias. Curiosamente, mostramos anteriormente que a inativação de WASp em camundongos ("Wasp-knockout"-WASp-KO) resulta em número reduzido de células T reguladoras (Treg) no timo e na periferia. Entretanto, ainda não se sabe como a WASp constitutivamente ativa afeta a função das células Treg. Neste projeto, avaliamos o impacto das mutações em WASp na diferenciação de células Treg no timo de camundongos WASp-KO e de camundongos XLN (knock-in para mutações presentes na XLN). As células do timo de camundongos WT, WASp-KO e XLN foram analisadas por citometria de fluxo para avaliação dos timócitos, células B e células dendríticas. Para avaliar se as células provenientes de camundongos WASp-KO e XLN eram capazes de se diferenciar em células Treg, isolamos células CD4 SP e cultivamos com diferentes combinações de estímulos, como IL-2, TGF-\03B2, anti-CD3 e anti-CD28, por 12 a 72 horas, marcadas ou não com CFSE para rastrear células em proliferação Nossos resultados mostram que o timo dos animais WASp-KO apresenta diminuição significativa de células Treg, e os animais com mutação I296T-WASp apresentam leve diminuição dessas células. Quando comparadas aos camundongos WT, as células B tímicas estão diminuídas nos camundongos WASp-KO. Além disso, usando ensaios de diferenciação in vitro, descobrimos que timócitos CD4 SP de camundongos WASp-KO mostram diferenciação reduzida para células Treg. Apesar desse defeito, as células CD4 SP deficientes em WASp apresentam sinalização eficiente após estimulação com IL-2 e TGF-\03B2, medida pela regulação positiva da expressão de fosfo-Stat5 e fosfoSmad2/3, respectivamente. Embora as células obtidas dos camundongos WASp-KO tenham regulado positivamente o fator de transcrição Foxp3, elas não proliferaram, levando a um número menor de células Treg Foxp3+. Curiosamente, as células CD4 SP dos animais XLN proliferaram mais rapidamente quando comparadas às células do animal WT, tendo uma maior fração das células XLN Foxp3-, que pode ser causada pela rápida proliferação. Nós fornecemos evidências de que o timo de camundongos mutantes em WASp apresentou alterações em subpopulações de timócitos e de outras células tímicas. Por fim, esses resultados mostram que diferentes mutações em WASp afetam a diferenciação das células Treg de maneira bastante distinta, sugerindo um papel central da WASp durante o desenvolvimento das células T.