Aplicação do método de ressonância magnética nuclear para identificação e quantificação de polissacarídeos meningocócicos sorogrupos C e W135

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Leal, Ana Paula Fernandes
• Orientador(a): Silveira, Ivna Alana F. B. da, Carvalho, Érika Martins de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/25111

Bio-Manguinhos tem sido, nos últimos anos, o único produtor brasileiro de vacinas meningocócicas que são utilizadas para o controle da doença meningocócica. Para garantir a eficácia destas vacinas, são verificados dois fatores determinantes no controle de qualidade: a pureza, dada pela concentração de ácido siálico, e a concentração de O-acetil dos polissacarídeos. O polissacarídeo meningocócico C (PSC) é constituído de ácido siálico enquanto o polissacarídeo W135 (PSW135) é constituído de ácido siálico e galactose. O método clássico utilizado no controle destas moléculas é a espectroscopia UV-Vis (Svennerholm e Hestrin), que demanda um grande número de manipulações no preparo das amostras, impactando negativamente no resultado final da análise. A espectroscopia de RMN é capaz de minimizar tal problema, possibilitando, ainda, a redução na quantidade de amostra e tempo de análise, sem a necessidade da construção de uma curva de calibração. O presente trabalho tem como objetivo a utilização de RMN de 1H para identificação e quantificação (RMNq) dos PSC e PSW135, utilizando o experimento GARP. A identidade das moléculas em estudo foi verificada através da comparação com os espectros dos padrões de ácido siálico (NANA) e galactose, para confirmação dos assinalamentos dos polissacarídeos e da escolha do sinal a ser quantificado, e com os resultados descritos na literatura Os parâmetros para a quantificação foram otimizados em função da razão sinal/ruído, e o tempo de espera foi determinado usando o método inversão-recuperação. Os parâmetros de aquisição dos espectros quantitativos foram: d1 = 25seg; ns = 64 e T = 313K. Os sinais utilizados para a quantificação do PSC foram H-7 e H-8 e região em 3,30 a 4,20ppm; e do PSW135 foi o H-3eq. A sequência GARP gerou valores de pureza e teor de OAc menores do que àqueles obtidos com a sequência padrão, mostrando a importância da remoção dos satélites 13C para a quantificação dos analitos. O método de Eletroforese Capilar foi adaptado como método alternativo de quantificação do PSW135, gerando resultados satisfatórios. Foram realizados estudos de pré-validação do método de RMNq para a quantificação do PSW135, o qual atendeu aos requisitos preconizados pela ANVISA. Os resultados obtidos pelos três métodos estudados neste trabalho apresentaram-se satisfatórios, onde ambos os polissacarídeos tem pureza acima de 80% e o PSC possui um teor de OAc acima de 1,5\03BCmol/mg. A análise estatística mostrou diferenças significativas entre os três métodos, porém todos podem ser utilizados na quantificação das moléculas. Dentre estes métodos, a RMNq apresenta vantagens pois é um método rápido e capaz de determinar a identidade, pureza e o teor de O-acetilação dos polissacarídeos em um único experimento. Em conclusão, o método proposto gera resultados satisfatórios, porém ainda necessita de pequenos ajustes para ser introduzido na rotina de controle de qualidade dos polissacarídeos meningocócicos, utilizados na produção das vacinas meningocócicas polissacarídicas e conjugadas em Bio-Manguinhos.