Identificação de uma possível histona-linker em Toxoplasma gondii

• Ano de defesa: 2018
• Autor(a) principal: Severo, Vanessa Rossini
• Orientador(a): Nardelli, Sheila Cristina
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas.
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32006

A estrutura da cromatina é uma barreira que limita o acesso ao DNA pelos complexos proteicos. A alternância do nível de compactação da cromatina é regulada principalmente pelas histonas e suas modificações pós traducionais (MPTs). Toxoplasma gondii (T. gondii) possui as quatro histonas canônicas (H2A, H2B, H3 e H4), mas até o momento a quinta histona, H1 (ou histona-linker) não foi identificada. Em outros eucariotos, a histona H1 é parte fundamental na compactação da cromatina e sua ausência poderia levar a um estado menos compactado da cromatina em T. gondii. Identificamos uma possível histona H1, similar a H1-like de Kinetoplastidae, e que corresponde apenas à porção C-terminal de uma histona H1 típica, a qual denominamos TgH1-like. Através de análise estrutural in silico, verificamos que a proteína apresenta características comuns a histonas como um potencial eletrostático bastante positivo, devido à abundância em lisinas e argininas nessas proteínas. Para predição da função de TgH1-like, utilizamos o servidor ProFunc, onde obtivemos correspondência com modelo de histona h1b, sugerindo que TgH1-like poderia ter função de histona em Toxoplasma. Para caracterizar TgH1-like, realizamos o etiquetamento do epitopo do gene endógeno. Através de ensaio de imunofluorescência, foi possível verificar que a TgH1-like está localizado exclusivamente no núcleo do parasita. No entanto, por ensaios de western blot, TgH1-like-HA migrou como uma proteína de ~20 kDa, ao invés dos 9 kDa esperados para sua massa presvista. As histonas H1, assim como as demais histonas, são alvo de diversas MPTs, como metilação, acetilação, fosforilação e ubiquitinação. Recentemente foram identificados diversos sítios de ubiquitinação em proteínas de Toxoplasma, incluindo TgH1-like, o que corresponderia a um aumento de tamanho compatível com o encontrado. Para verificar se TgH1-like está associada a cromatina de T. gondii, realizamos um protocolo de extração de histonas por fracionamento celular, onde confirmamos a sua localização nuclear, e observamos uma parcela associada ao DNA juntamente com outras histonas, como a H4. Essa interação foi confirmada por ensaio de coimunoprecipitação, mostrando que a histona H4 precipita juntamente com a TgH1-like. Em busca de dados funcionais, realizamos o nocaute de tgh1-like, que não mostrou-se essencial a sobrevivência do parasita. Ensaios preliminares com parasitas DTgH1-like, através de ensaio de placa, resultou em um número de placas de lise maior quando comparado a parasitas controles, indicando que a replicação celular está alterada nesses parasitas. Corroborando esses dados, ensaios de imunofluorescencia indicaram um número maior de parasitas por vacúolo. Juntos, nossos dados indicam que TgH1-like está associada ao DNA e forma um complexo com outras histonas. Além disso, parasitas nocautes apresentaram alteração no ciclo celular do parasita, embora mais evidências sejam necessárias para corroborar tal alteração. Mostramos que TgH1-like apresenta características de histonas, não é essencial ao parasita, e outras análises funcionais estão em andamento para confirmarmos seu papel em T. gondii.