Regulação da expressão do gene TcSof1 em Trypanosoma cruzi

• Ano de defesa: 2014
• Autor(a) principal: Poubel, Saloê Bispo
• Orientador(a): Dallagiovanna, Bruno
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Instituto Carlos Chagas
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/8949

O Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da Doença de Chagas. O controle da expressão de genes é fundamental para gerar as mudanças morfológicas durante o ciclo de vida do parasita. Entretanto, os tripanosomatídeos possuem peculiaridades quanto a sua biologia molecular, como por exemplo, a transcrição policistrônica e a ausência de promotores definidos para a RNA polimerase II. Acredita-se, portanto, que grande parte da regulação da expressão gênica nestes parasitas ocorra em nível pós-transcricional por mecanismos que envolvem mudanças na estabilidade e no acesso dos mRNAs aos polissomos. Estudos prévios do nosso grupo mostraram que alguns mRNAs que codificam proteínas do complexo proceossomo (SSU) em T. cruzi são mais abundantes em tripomastigotas metacíclicos que em epimastigotas. No entanto, apesar da grande quantidade de mRNAs da proteína TcSof1 nas formas infectantes, o mRNA de TcSof1, esta imobilizado dentro dos polissomos e não é traduzido. O sequestro de mRNA dentro polissomos é uma maneira de bloquear a tradução, sugerindo um mecanismo de regulação negativa da tradução, provavelmente nas etapas de elongação e terminação. O objetivo do nosso trabalho foi caracterizar os mecanismos de regulação da expressão gênica envolvidos na expressão negativa do gene de TcSof1 na forma tripomastigota metacíclica de T. cruzi. Primeiramente isolamos e analisamos mais de 500 RNAs pequenos na forma metaciclica que pudessem estar regulando negativamente a tradução de TcSof1. Embora, nenhum RNA regulador tenha sido identificado, uma grande população de fragmentos de tRNAs foi encontrada. Sua participação na maquinaria de tradução ativa foi excluída, uma vez que os mesmos não foram detectados associados aos polissomos ou ribossomos. Padronizamos e empregamos a técnica de Ribossome Footprinting para a análise da eficiência de tradução em T. cruzi, avaliando a população de mRNA total e os mRNA que estavam associados aos ribossomos, provenientes da forma metacíclica. Os resultados mostraram que de aproximadamente 9.000 genes presentes nesta etapa do ciclo de vida, apenas 4.241 estavam associados aos ribossomos nas amostras do footprinting, ao contrário do que foi visto na forma epimastigota, onde dos 9.000 genes presentes 7. 419 genes estavam associados aos polissomos. Este resultado indica que quase a metade dos genes transcritos nas formas tripomastigotas estão sendo regulados negativamente, provavelmente em nível de tradução. Confirmamos com esta técnica a presença do mRNA de TcSof1 associado aos polissomos na forma metacíclica mesmo sem haver expressão da proteína nesta forma, e outros genes que apresentam o mesmo padrão de expressão também foram analisados. Através do tratamento dos parasitas com a droga harringtonina, um inibidor da tradução, seguido das análises por Ribosome Footprinting, foi possível evidenciar um acúmulo de ribossomos nos locais de inicio da tradução da maioria dos mRNAs mostrando que a droga bloqueia os ribossomos no sitio de inicio da tradução. Pelo contrario, o mRNA de TcSof1 apresentou marcas de ribossomo ao longo de toda a região codificante do gene nas formas metacíclicas, sugerindo que os ribossomos estão parados na etapa de elongação da tradução. Este resultado confirmou que a ausência de expressão desta proteína nesta etapa do ciclo de vida do parasita, é controlada em nível de tradução por um mecanismo de parada dos ribossomos nos polissomos.