Análise funcional dos genes Ferro Superóxido Dismutase-A e Proteína de Membrana dos Kinetoplastídeos-11 em linhagens de Leishmania selvagens e resistentes ao antimonial trivalente

• Ano de defesa: 2013
• Autor(a) principal: Tessarollo, Nayara Gusmão
• Orientador(a): Murta, Silvane Maria Fonseca
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/6762

Em nosso estudo caracterizamos a enzima ferro superóxido dismutase-A (FeSOD-A)e a proteína de membrana dos kinetoplastídeos-11 (KMP-11) em linhagens de Leishmania spp. do Novo Mundo selvagens e resistentes aos antimoniais. Ambas proteínas apresentam grande relevância no metabolismo do parasito, visto que a enzima FeSOD-A está envolvida na defesa antioxidante e KMP-11, presente na superfície da membrana dos kinetoplastídeos, pode estar relacionada ao fenótipo de resistência do parasito ao antimonial. Análise de Southern blot mostrou a presença de polimorfismos na sequência do gene FeSOD-A entre as linhagens de Leishmania avaliadas. A expressão de FeSOD-A foi analisada utilizando anticorpo policlonal (TcFeSOD) que reconheceu um polipeptídio de 26 kDa em todas as linhagens estudadas. Quantificação por qPCR mostrou que o mRNA do gene é 3,6X menos expresso na linhagem L. guyanensis resistente LgSbR, por outro lado a proteína está 2,0X mais expressa nessa linhagem. A FeSOD-A está 3,0X menos expressa em L. amazonensis resistente LaSbR, mas o nível de mRNA foi o mesmo entre as linhagens LaWTS e LaSbR. Ensaios de atividade enzimática mostraram que FESOD-A possui maior atividade nas linhagens resistentes de L. braziliensis e L. infantum chagasi (LbSbR e LcSbR) comparado com as linhagens selvagens. A análise funcional foi realizada para determinar se a superexpressão do gene FeSOD-A nas linhagens LbWTS/LbSbR e LcWTS/LcSbR iria alterar o fenótipo de resistência dos parasitos transfectados. Ensaios de Western blot e de atividade enzimática mostraram que o nível de expressão da proteína e atividade da FeSOD-A foram maiores nos parasitos transfectados em comparação com os não-transfectados. Análise IC50 do SbIII mostrou que a superexpressão FeSOD-A nas linhagens de LbWTS e LcWTS aumentou 1,7X e 1,6X o fenótipo de resistência ao antimônio, respectivamente. A superexpressão da enzima FeSOD-A na linhagem LbSbR reduziu o fenótipo resistência, enquanto que na linhagem LcSbR não houve alteração no fenótipo. Resultados de tolerância ao estresse oxidativo induzido por paraquat mostrou que o clone superexpressor de LbWTS apresentou maior proteção ao estresse comparado à linhagem não-transfectada. Concluindo, nossos resultados sugerem que a enzima FeSOD-A está envolvida no fenótipo de resistência de L. braziliensis e L. chagasi ao antimonial. Para o gene KMP-11 análise por Southern blot mostrou semelhante perfil de hibridização entre as diferentes espécies analisadas, com exceção da linhagem LgWTS que apresentou perfil de fragmentos diferentes. Análise de Northern blot revelou a presença de dois transcritos, 1,0 Kb e 3,0 Kb, em todas as linhagens de Leishmania spp., com exceção da linhagem LgWTS que apresentou apenas um transcrito de 1,0 Kb. Quantificação por qPCR mostrou que mRNA do gene KMP-11 está 2,9X menos expresso na linhagem de LbSbR e 1,5X mais expresso na linhagem LcSbR comparado com os respectivos pares selvagens. A expressão de KMP-11 utilizando anticorpo policlonal anti-KMP-11, mostrou que ele reconheceu um polipeptídio de 11 kDa em todas as linhagens de Leishmania spp. estudadas. Análises de densitometria mostraram que KMP-11 está 1,5X mais expressa em LcSbR comparado com o par selvagem LcWTS e 2,0X menos expressa em LbSbR comparado ao par LbWTS. Ensaios de transfecção do gene KMP-11 foram realizados nas linhagens LbWTS e LbSbR. Análise de Western blot mostrou maior expressão da proteína KMP-11 nos parasitos resistentes transfectados. Avaliação da susceptibilidade ao SbIII mostrou que a superexpressão de KMP-11 na linhagem selvagem de LbWTS não alterou o fenótipo. Por outro lado, a superexpressão dessa proteína na linhagem resistente (LbSbR) reduziu o fenótipo resistência. Ensaios in vitro e in vivo com as linhagens LbWTS não-transfectadas e os clones transfectados com KMP-11 não mostraram diferenças quanto à infectividade dos parasitos em células THP-1 e em camundongos nocaute para interferon-γ. Apenas o clone 6 apresentou menor infectividade em camundongos. Estudos adicionais são necessários para investigar melhor a possível participação da proteína KMP-11 no fenótipo de resistência ao antimonial e na infectividade dos parasitos.