Caracterização e avaliação de moléculas de Culex quinquefasciatus associadas a resistência a Lysinibacillus sphaericus

• Ano de defesa: 2023
• Autor(a) principal: Menezes, Heverly Suzany Gouveia de
• Orientador(a): Silva-Filha, Maria Helena Neves Lobo
• Tipo de documento: Tese
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Link de acesso: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/59862

A resistência de larvas de Culex quinquefasciatus à toxina Binária (Bin) de Lysinibacillus sphaericus, pode ser causada por mutações no gene do receptor da toxina Bin. Em nosso laboratório, uma colônia resistente selecionada com o L. sphaericus cepa IAB59 vem sendo utilizada como modelo de estudo e sua refratariedade é causada pelo alelo cqm1REC que impede a expressão do receptor Cqm1. Um estudo prévio mostrou que as larvas resistentes, comparadas às suscetíveis, apresentam um transcriptoma diferencial com um padrão de transcrição alterado para genes ligados ao metabolismo de lipídios, carboidratos, proteínas, de xenobióticos, entre outros. O objetivo deste estudo foi validar funcionalmente e investigar estas moléculas que podem estar de alguma forma associadas ao status de resistência de Cx. quinquefasciatus. Para tal, a atividade de enzimas selecionadas foi determinada em intestinos de larvas resistentes e suscetíveis. Em relação às lipases, as larvas resistentes mostraram uma atividade menor para os substratos acetato (R= 331,5 ± 24,4, S= 381,8 ± 22,8), butirato (R= 206,3 ± 9,6, S= 257,7 ± 17,3) e heptanoato (R= 121,1 ± 10,06, S= 188,5 ± 14,8). A atividade sobre os substratos oleato, e palmitato não mostrou uma diferença significativa. A atividade de α-glicosidases utilizando o substrato sacarase mostrou uma atividade significativamente reduzida em larvas resistentes (R= 62,25 ± 4,8; S=112 ± 4), enquanto esta atividade foi similar para o substrato MuαGlu. A atividade de proteases e de enzimas detoxificadoras glutationa-S-transferases, por sua vez, foi similar para as duas colônias. Foram avaliadas as reservas de lipídios e açúcares redutores e o perfil de larvas e adultos da colônia resistente foi caracterizado pela redução significativa do acúmulo de lipídios (58%) e maior quantidade de açúcares redutores (35%). Contudo, a fertilidade e fecundidade foi semelhante para as duas linhagens, indicando que as alterações nas reservas não afetaram esses parâmetros. Este estudo também visou a identificação e caracterização parcial de uma panteteinase cujo transcrito foi o mais reprimido no transcriptoma de larvas resistentes. O gene foi clonado e expresso em células Sf9 e revelou uma proteína de cerca de 70 kDa, maior do que o predito de 57 kDa. A análise in silico da sequência apresentou três potenciais sítios de N-glicosilação. Uma discreta presença de N-glicosídeos (1 kDa) foi detectada em ensaios in vitro, porém este achado não justifica a discrepância entre os pesos, assim, a proteína deve sofrer outras alterações pós-traducionais. A quantificação relativa da transcrição de panteteinase em larvas em larvas suscetíveis mostrou uma grande variação na expressão entre indivíduos, enquanto o transcrito estava reprimido em todas as larvas resistentes (S= 2,3 ± 2, R= 0,19 ± 0,1). A investigação da expressão de panteteinase nativa em larvas mostrou uma proteína de 70 kDa que foi imunodetectada pelo anticorpo anti-panteteinase em amostras de microviili de intestino, o que sugere a sua localização como uma proteína de membrana. Em conclusão, Cx. quinquefasciatus resistentes à Bin possuem características metabólicas diferenciais e a identificação da panteteinase como um segundo marcador da resistência à toxina Bin abre perpectivas para investigação do papel destas moléculas.