Detalhes bibliográficos
| Ano de defesa: |
2006 |
| Autor(a) principal: |
Silveira, Tatiana Nunes |
| Orientador(a): |
Gazzinelli, Ricardo Tostes,
Romanha, Alvaro José |
| Banca de defesa: |
Não Informado pela instituição |
| Tipo de documento: |
Dissertação
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| Tipo de acesso: |
Acesso aberto |
| Idioma: |
por |
| Instituição de defesa: |
Não Informado pela instituição
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| Programa de Pós-Graduação: |
Não Informado pela instituição
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| Departamento: |
Não Informado pela instituição
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| País: |
Não Informado pela instituição
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| Link de acesso: |
https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/32993
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Resumo: |
RasGEF1b é um fator de troca de nucleotídeos guanina (GEF) hipotético e altamente conservado. Esse gene contém um domínio RASGEFN com um motivo zíper de leucina e um domínio RASGEF com três sítios de localização nuclear. A expressão do mRNA do RasGEF1b em macrófagos é induzida por diferentes agonistas de receptores do tipo Toll (TLRs), tais como LPS (TLR4), GPI-mucina (TLR2) e Poli I:C (TLR3). A fim de expressar a proteína recombinante, nós clonamos o cDNA do RasGEF1b no vetor pQE-30, utilizado para transformar bactérias E. coli (XL1-Blue). A His-RasGEF1b expressa em bactérias foi purificada utilizando tampão com alto conteúdo de uréia, seguido por cromatografia de afinidade utilizando resina carregada com níquel. A expressão da proteína foi confirmada em gel 2D, análise por espectometria de massa e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-His. Além disso, o cDNA do RasGEF1b foi inserido em um plasmídeo que permite a fusão do epitopo FLAG (pFLAGCMV2) com a proteína RasGEF1b. O pFLAGCMV2 codificando o cDNA do RasGEF1b foi utilizado para transfectar células HEK293T e a expressão protéica foi avaliada com gel 2D gel e Western blotting utilizando um anticorpo monoclonal anti-FLAG. A proteína reconhecida pelo anti-FLAG mostrou um peso molecular aparente de 56 KDa e ponto isoelétrico de 7,25. Utilizando a técnica de centrifugação diferencial e anticorpos monoclonais para as proteínas específicas das diferentes frações subcelulares, nós demonstramos que a proteína FLAG-RasGEF1b estava presente principalmente nas frações de núcleo e de membranas pesadas. Através do alinhamento entre seqüências da RasGEF1b de diferentes espécies filogeneticamente distintas vimos que esta proteína é altamente conservada com similaridade de 57 por cento a 97 por cento em relação à RasGEF1b murina. |
