Engenharia metabólica de Komagataella phaffii para produção de ácido glicólico a partir de biomassa lignocelulósica
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| المؤلف الرئيسي: | |
|---|---|
| تاريخ النشر: | 2024 |
| التنسيق: | Master thesis |
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| المصدر: | Repositório Institucional da UnB |
| Download full: | http://repositorio.unb.br/handle/10482/51834 |
الملخص: | O ácido glicólico (AG) é um ácido orgânico produzido pela indústria petroquímica e largamente comercializado como cosmético para esfoliação da pele e rejuvenescimento. Além disso, é empregado na indústria têxtil para curtir e pigmentar tecidos, na indústria alimentícia como conservante e acidulante, e na fabricação de polímeros de relevância médica, como o poli(ácido glicólico) e o poli(ácido lático-co-ácido glicólico). Atualmente, a produção do AG se dá por via química a partir de derivados do petróleo, o que gera impactos negativos ao meio ambiente e ao ser humano. Dessa maneira, o uso de biomassa lignocelulósica como substrato para a produção de AG em processos biológicos se apresenta como alternativa sustentável à rota química. Nesse contexto, foi construída pelo grupo de pesquisa uma linhagem de K. phaffii com capacidade de conversão de xilose a etilenoglicol (EG) e a AG por meio da introdução da via heteróloga de Dahms. Na levedura recombinante, foi constatado que a última etapa da via sintética, a conversão de glicoaldeído a AG ou EG, era realizada respectivamente por aldeído redutases (ALDR) e aldeído desidrogenases (ALDH) nativas da levedura. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo a otimização do processo de produção de AG por meio da caracterização dos genes envolvidos na última etapa da via, que poderão ser deletados ou superexpressos, de acordo com sua função, na levedura que expressa a via de Dahms, para obter maior produção de AG. Para isso, cinco genes putativos de ALDR’s e ALDH’s foram selecionados com base na similaridade de sequência a genes de referência para serem avaliados quanto à sua atividade sobre glicoaldeído. Foram construídos cassetes de deleção para três desses genes, porém não foi possível identificar linhagens com os genes deletados após vários ciclos de transformação. Além disso, para a otimização dos parâmetros do processo de produção de AG, a linhagem de K. phaffii que expressa a via de produção de AG foi cultivada em biorreator em diferentes condições de pH e DO (oxigênio dissolvido), de acordo com um delineamento central composto rotacional (DCCR). A partir do DCCR, foi possível determinar que existe influência do pH e do DO para a produção de AG pela K. phaffii engenheirada. Por fim, a levedura engenheirada foi cultivada em biorreator com hidrolisado de biomassa de canade-açúcar como meio de alimentação para validar a produção de AG a partir dessa fonte de carbono. Foi possível alcançar a produção de 8,51 ± 0,23 g/L de AG a partir de hidrolisado, valor superior aos descritos na literatura para leveduras. Os resultados demonstram estratégias genéticas e de processo para otimização do processo de produção de AG em K. phaffii. |
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Atualmente, a produção do AG se dá por via química a partir de derivados do petróleo, o que gera impactos negativos ao meio ambiente e ao ser humano. Dessa maneira, o uso de biomassa lignocelulósica como substrato para a produção de AG em processos biológicos se apresenta como alternativa sustentável à rota química. Nesse contexto, foi construída pelo grupo de pesquisa uma linhagem de K. phaffii com capacidade de conversão de xilose a etilenoglicol (EG) e a AG por meio da introdução da via heteróloga de Dahms. Na levedura recombinante, foi constatado que a última etapa da via sintética, a conversão de glicoaldeído a AG ou EG, era realizada respectivamente por aldeído redutases (ALDR) e aldeído desidrogenases (ALDH) nativas da levedura. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo a otimização do processo de produção de AG por meio da caracterização dos genes envolvidos na última etapa da via, que poderão ser deletados ou superexpressos, de acordo com sua função, na levedura que expressa a via de Dahms, para obter maior produção de AG. Para isso, cinco genes putativos de ALDR’s e ALDH’s foram selecionados com base na similaridade de sequência a genes de referência para serem avaliados quanto à sua atividade sobre glicoaldeído. Foram construídos cassetes de deleção para três desses genes, porém não foi possível identificar linhagens com os genes deletados após vários ciclos de transformação. Além disso, para a otimização dos parâmetros do processo de produção de AG, a linhagem de K. phaffii que expressa a via de produção de AG foi cultivada em biorreator em diferentes condições de pH e DO (oxigênio dissolvido), de acordo com um delineamento central composto rotacional (DCCR). A partir do DCCR, foi possível determinar que existe influência do pH e do DO para a produção de AG pela K. phaffii engenheirada. Por fim, a levedura engenheirada foi cultivada em biorreator com hidrolisado de biomassa de canade-açúcar como meio de alimentação para validar a produção de AG a partir dessa fonte de carbono. Foi possível alcançar a produção de 8,51 ± 0,23 g/L de AG a partir de hidrolisado, valor superior aos descritos na literatura para leveduras. Os resultados demonstram estratégias genéticas e de processo para otimização do processo de produção de AG em K. phaffii.Glycolic acid (GA) is an organic acid produced by the petrochemical industry and widely marketed as a cosmetic for skin exfoliation and rejuvenation. Additionally, it is employed in the textile industry for leather tanning and fabric dyeing, in the food industry as a preservative and acidulant, and in the manufacturing of medically relevant polymers, such as poly(glycolic acid) and poly(lactic-co-glycolic acid). Currently, GA is chemically produced from petroleum derivatives, which generates negative impacts on the environment and human health. Thus, the use of lignocellulosic biomass as a substrate for GA production through biological processes is presented as a sustainable alternative to the chemical route. In this context, this research group has constructed a K. phaffii strain with the capacity to convert xylose to ethylene glycol (EG) and GA through the introduction of the heterologous Dahms pathway. In the recombinant yeast, it was found that the last step of the synthetic pathway, the conversion of glycolaldehyde to GA or EG, was performed by native yeast aldehyde reductases (ALDR) and aldehyde dehydrogenases (ALDH), respectively. Thus, the objective of this work is to optimize the GA production process through the characterization of the genes involved in the last step of the pathway, that could be deleted or superexpressed, according to its function, in the yeast strain that expresses the Dahms pathway, for GA production optimization. For this purpose, five putative ALDR's and ALDH's genes were selected based on sequence similarity to reference genes to be evaluated for their activity on glycolaldehyde. Deletion cassettes for 3 of these genes were constructed, however it was not possible to identify strains with deleted genes after several transformation cycles. Furthermore, for the optimization of the GA production process parameters, the K. phaffii strain expressing the complete GA production pathway was cultured in a bioreactor under different pH and DO (dissolved oxygen) conditions, according to a central composite rotational design (CCRD). The CCRD enabled the determination of the influence of pH and DO conditions for GA production by the engineered K. phaffii. Lastly, the engineered yeast was cultivated in a bioreactor fed with sugarcane biomass hydrolysate to validate the production of GA from this carbon source. A production of 8,51 ± 0,23 g/L of GA was achieved from hydrolysate, a value superior to those reported in literature for yeasts. These results highlight genetic and process strategies for the optimization of the GA production process in K. phaffii.Instituto de Ciências Biológicas (IB)Departamento de Biologia Celular (IB CEL)Programa de Pós-Graduação em Biologia MicrobianaporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.unb.br, www.ibict.br, www.ndltd.org sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra supracitada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessEngenharia metabólica de Komagataella phaffii para produção de ácido glicólico a partir de biomassa lignocelulósicainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisÁcido glicólicoFermentaçãoKomagataella phaffiiEngenharia metabólicaPichia pastorisreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINALTulioMarcosGodoyDeAndrade_DISSERT.pdfapplication/pdf2947621http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/51834/1/TulioMarcosGodoyDeAndrade_DISSERT.pdf525d0c237807333a4c7b19afc0d356d5MD51open access10482/518342025-03-12 16:15:35.377open accessoai:repositorio.unb.br:10482/51834Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2025-03-12T19:15:35Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB) |
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