Caracterização da N-acetil-ß-D-glicosaminidase de Paracoccidioides brasiliensis
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O anticorpo produzido anti-PbNAG apresentou reação com a proteína nativa, em extrato total, de micélio e levedura de P. brasiliensis. Na imunocitolocalização o anticorpo anti-PbNAG reagiu com a proteína NAG nativa presente na parede de células leveduriformes P. brasiliensis. A enzima recombinante PbNAG foi caracterizada apresentando afinidade pelo substrato ρ-nitrofenil-β-D-N-acetilglucosamina (ρNP-GlcNAc), com Km de 0.112 mM, Vmax de 0.0017 mM min-1 mg proteina-1, temperatura ótima de 37ºC e pH ótimo de 4.4. A enzima foi pouco inibida por glicose e apresentou inibição por glicosamina, N-acetilglicosamina. Os estudos mostram que PbNAG está presente na parede celular de células leveduriformes de P. brasiliensis, sugerindo seu papel no metabolismo da parede fúngica. ____________________________________________________________________________________ ABSTRACTThe full-length cDNA Pbnag enconding a N-acetyl-β-Dglucosaminidase (NAG) GeneBank accession number AF 419158 of Paracoccidioides brasiliensis was characterized and classified as a NAG belonging to the glycosil hydrolase family 20. The PbNAG was expressed in Escherichia coli and purified to homogeneity by affinity chromatography on glutathione-Sepharose 4B. SDS-PAGE analysis revealed the presence of one protein species with molecular mass estimated of 64.8 kDa. Immunoelectron microscopy demonstrated the presence of the native protein in the cell wall of P. brasiliensis. The recombinant protein was evaluated regarding to its kinetics properties The Km and Vmax values for the enzyme using ρ- nitrophenyl-β-D-N-acetylglucosamine (ρNP-GlcNAc) as substrate, were 0.112 mM and 0.0017 mM, respectively. The pH optimum for the enzyme was 4.4 and maximum activity was obtained at 37 °C. The enzyme activity was poorly affected by glucose and was inhibited by glucosamine, Nacetylglucosaminide. The studies show that PbNAG is present in the cell wall of yeast cells of P. brasiliensis suggesting its potential role in the fungal cell wall additionally.Faculdade de Medicina (FM)Programa de Pós-Graduação em Patologia MolecularCaracterização da N-acetil-ß-D-glicosaminidase de Paracoccidioides brasiliensisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisPatologia molecularBRAinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF2007_MonicadeOliveiraSantos.PDFapplication/pdf948235http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/3037/1/2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF8bcc87f3398c3399d83dc39e4e2a3cbaMD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain1874http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/3037/2/license.txt9daaf7abf8284aad3a436db9b1e1e323MD52open accessTEXT2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF.txt2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF.txtExtracted texttext/plain94529http://repositorio.unb.br/bitstream/10482/3037/3/2007_MonicadeOliveiraSantos.PDF.txt61dae6af46ec4d741a2bc9c8cc71bb6cMD53open access10482/30372025-01-14 16:59:35.167open accessoai:repositorio.unb.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestrepositorio@unb.bropendoar:2025-01-14T19:59:35Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB) |
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