Caracterização do fator de transcrição ShSHN1 de cana-de-açúcar e sua relação com a biossíntese da parede celular em plantas transgênicas de arroz - Martins, Alexandre Palma Boer (2017)
O melhoramento genético de culturas com elevada capacidade para produção de biomassa, como a cana-de-açúcar, apresenta grande importância no desenvolvimento de matérias primas que possam ser utilizadas como fonte renovável de energia. A biomassa vegetal possui grande potencial para a produção de etanol 2G, contudo a lignina, um componente estrutural da parede celular vegetal, dificulta o processo de sacarificação e obtenção deste biocombustível. Para superar esta limitação, muitos genes têm sido identificados e utilizados para alterar o conteúdo e/ou composição da lignina, bem como de outros constituintes da parede celular, através de engenharia genética. Dentre eles, alguns fatores de transcrição membros do clado SHINE (SHN) têm sido considerados alvos promissores recentes. A fim de se avaliar funcionalmente o FT ShSHN1 de cana-de-açúcar e sua possível relação com a biossíntese da parede celular, este gene foi isolado e superexpresso em arroz (Oryza sativa), uma planta monocotiledônea modelo. Para isso, um vetor de transformação genética foi construído utilizando o sistema Gateway de recombinação - contendo o promotor constitutivo Ubi-1 regulando a expressão de ShSHN1 - e calos embriogênicos foram transformados via Agrobacterium tumefaciens. O DNA extraído a partir das plantas regeneradas em meio contendo higromicina foi purificado para a confirmação dos eventos transgênicos por PCR. A expressão relativa do transgene e de possíveis genes alvo do FT ShSHN1 foi avaliada por qPCR e o número de cópias estimado por Taqman®. Linhagens transgênicas com cópia única foram cultivadas em casa de vegetação e submetidas a analises biométricas, bioquímicas e moleculares. Além disso, a localização subcelular de ShSHN1 foi analisada por expressão transiente em células de tabaco utilizando a detecção por GFP. Como resultados, a fluorescência da GFP foi observada exclusivamente no núcleo das células transformadas. Além disso, foram obtidas 12 linhagens transgênicas ShSHN1 em arroz, das quais três apresentam níveis de expressão elevados, sendo selecionadas para caracterização funcional (6A, 19A e 20A). As análises de expressão gênica de possíveis genes alvo indicaram alterações nos padrões de genes de lignina, celulose, hemicelulose, além de cera e cutina, nas linhagens ShSHN1. Complementarmente, as análises biométricas revelaram um aumento no crescimento vegetativo das plantas, com acréscimos significativos em parâmetros como número total de perfilhos, altura máxima da planta, comprimento e largura da folha bandeira, além de um incremento em até 50% no conteúdo de biomassa seca quando comparadas ao WT. As análises dos componentes da parede celular indicaram a redução na quantidade de lignina total em até 40% e um aumento na quantidade de pectinas em até 200%. A eficiência no processo de sacarificação também apresentou uma melhora significativa com valores até 50% superiores em relação ao grupo controle. A diminuição no conteúdo de lignina, o aumento da biomassa, e a maior eficiência no processo de sacarificação aqui obtidos, evidencia o grande potencial de estudo e aplicação do FT ShSHN1 na pesquisa e desenvolvimento de biocombustíveis como o etanol 2G, abrindo novos horizontes para a engenharia genética de culturas energéticas como a cana-de-açúcar.