Métodos bacteriológicos aplicados à tuberculose bovina: comparação de três métodos de descontaminação e de três protocolos para criopreservação de isolados - Ambrosio, Simone Rodrigues (2005)
Dada a importância do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e Tuberculose (PNCEBT), a necessidade de uma eficiente caracterização bacteriológica dos focos como ponto fundamental do sistema de vigilância e as dificuldades encontradas pelos laboratórios quanto aos métodos de isolamento de Mycobacterium bovis fizeram crescer o interesse do meio científico por estudos, sobretudo moleculares, de isolados M. bovis. Para a realização dessas técnicas moleculares, é necessária abundância de massa bacilar, obtida através da manutenção dos isolados em laboratório e repiques em meios de cultura. Entretanto o crescimento fastidioso do M. bovis em meios de cultura traz grandes dificuldades para essas operações. Assim sendo, o presente estudo teve por objetivos: 1º) Comparar três métodos de descontaminação para homogeneizados de órgãos, etapa que precede a semeadura em meios de cultura, onde 60 amostras de tecidos com lesões granulomatosas, provenientes de abatedouros bovinos do Estado de São Paulo, foram colhidas e imersas em solução saturada de Borato de Sódio e transportadas para o Laboratório de Zoonoses Bacterianas do VPS-FMVZ-USP, onde foram processadas até 60 dias após a colheita. Essas amostras foram submetidas a três métodos de descontaminação: Básico (NaOH 4%), Ácido (H2SO4 12%) e 1- Hexadecylpyridinium chloride a 1,5% (HPC) e o quarto método foi representado pela simples diluição com solução salina (controle). Os resultados foram submetidos à comparação de proporções, pelo teste de χ², na qual verificou-se que o método HPC foi o que apresentou menor proporção de contaminação (3%) e maior proporção de sucesso para isolamento de BAAR (40%). 2º) Comparar três diferentes meios criopreservates para M. bovis, foram utilizados 16 isolados identificados pela técnica de spoligotyping. Cada um desses isolados foi solubilizado em três meios (solução salina, 7H9 original e 7H9 modificado), e armazenado em três diferentes temperaturas (-20ºC, -80ºC e -196ºC), sendo descongelado em três diferentes tempos (45, 90 e 120 dias de congelamento). Antes do congelamento e após o descongelamento foram feitos cultivos quantitativos em meios de Stonebrink Leslie. Os porcentuais de redução de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) nas diferentes condições foram calculados e comparados entre si através de métodos paramétricos e não-paramétricos. Os resultados obtidos foram: na análise da variável tempo, em 90 dias de congelamento foi observada uma maior proporção de perda de M. bovis, quando comparado ao tempo 120 dias (p=0,0002); na análise da variável temperatura, foi observada uma diferença estatística significativa entre as proporções de perda média nas temperaturas de -20ºC e -80ºC (p<0,05); na análise da variável meio, foi observada uma diferença significativa (p=0,044) entre os meios A e C, para 45 dias de congelamento e -20ºC de temperatura de criopreservação. Embora as medianas dos porcentuais de perdas de UFC terem sido sempre inferiores a 4,2%, permitiram sugerir que o melhor protocolo de criopreservação de isolados de M. bovis é solubilizá-los em 7H9 modificado e mantê-los à temperatura de -20ºC