Estudos estruturais e biofísicos de enzimas degradadoras de hemicelulose visando suas aplicações na biotecnologia industrial - Briganti, Lorenzo E. R. P. P. L. D. B. (2021)
As paredes celulares das plantas são estruturas que possuem diversas funções, entre elas conferir sustentação e proteção às mesmas. Essas paredes são formadas basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, além de outros compostos minoritários. A hemicelulose, o segundo componente mais abundante, que responde por cerca de 30% da parede celular, é composta por xilano, um polímero de xilose com decorações como arabinose e ácido metil-glucurônico, o que a torna um material recalcitrante. Para a degradação da hemicelulose e aproveitamento dos açúcares contidos nela, se faz necessária a hidrólise eficiente desse componente. O presente estudo teve como alvos enzimas degradadoras de xilano com a finalidade de produção de compostos de interesse industrial, como xilo-oligossacarídeos (XOS), xilose, que seria o monômero da cadeia de xilano, e xilulose, um isômero da xilose. Os XOS são conhecidos por serem prebióticos, com grande importância na indústria alimentícia e promovendo saúde e bem-estar. Já a xilulose é uma pentose aproveitada na produção de etanol por fermentação industrial, ao contrário da xilose, que não pode ser aproveitada nas mesmas condições. As enzimas estudadas foram as glicosil-hidrolases, ou GHs, sendo mais especificamente as GHs 10, 11 e 43, e a xilose isomerase. Foram utilizadas técnicas físicas para caracterização destas enzimas e entendimento sobre o mecanismo das mesmas. A GH10, que se mostrou uma boa produtora de XOS, teve desvendada o seu padrão de clivagem enzimático e conseguiu-se compreender a relação entre a estrutura cristalográfica da enzima e o perfil de produtos gerados pela mesma. A GH11, que possui um perfil enzimático incomum, indicando cooperatividade, teve a sua estrutura cristalográfica resolvida e, através de simulações de dinâmica molecular, compreendeu-se o papel do sítio secundário de ligação na estabilização da enzima e na diminuição da energia livre de interação com o ligante. A GH43, que possui afinidade maior por XOS maiores e cujo mutante F507A não apresenta atividade catalítica, teve sua estrutura cristalográfica resolvida, e através de análises estruturais e simulações de dinâmica molecular, compreendeu-se que as dobras que o ligante fazia em direção à enzima poderiam resultar em interações extras em XOS maiores, além do fato da mutação F507A estreitar o bolso catalítico da enzima, impedindo a acomodação de um ligante e consequentemente a atividade catalítica da mesma. Para a xilose isomerase, foram feitos extensivos estudos de caracterização, com a determinação de parâmetros como temperatura ótima (60 °C), pH ótimo (cerca de 8.0), termoestabilidade (50% de atividade residual após 72h a 50 °C), além de raio de giro (36 Å), determinação da estrutura cristalográfica, além de análises de conservação dos resíduos no grupo. Ensaios preliminares de fermentação foram realizados, mas outros testes, com diferentes técnicas de fermentação, devem ser realizados para encontrar a melhor forma de utilizar industrialmente essa enzima.