Suscetibilidade à miltefosina em isolados clínicos de Leishmania (Viannia) braziliensis: caracterização fenotípica e investigação das bases envolvidas na redução. de suscet - Espada, Caroline Ricce (2020)
O fármaco de primeira escolha no tratamento da leishmaniose tegumentar no Brasil, onde Leishmania (Viannia) braziliensis é o principal agente etiológico da doença, é o antimoniato de meglumina, de uso parenteral e com eficácia tão baixa quanto 50% em algumas regiões do país. Com o objetivo de avaliar o potencial da miltefosina para o tratamento de leishmaniose tegumentar no Brasil, caracterizamos a suscetibilidade de 16 isolados clínicos brasileiros e duas cepas referência de L. (V.) braziliensis a este fármaco. Observamos variabilidade caracterizada por valores de EC50 6 e 15 vezes maiores, em formas promastigota e amastigota, respectivamente, entre os isolados mais e menos suscetíveis ao fármaco. Buscamos entender as bases moleculares envolvidas nessas diferenças de suscetibilidade intrínseca através da caracterização, nesses isolados, de alguns dos mecanismos de resistência à miltefosina mais conhecidos em Leishmania. Para isso, elegemos os isolados com menor e maior EC50 em paralelo à cepa referência. Observamos diferenças na velocidade de entrada do fármaco e de sua acumulação entre os isolados, que se revelaram reduzidas nos isolados menos suscetíveis quando comparados com isolados mais suscetíveis e a cepa referência. Polimorfismos nos genes que codificam a maquinaria de transporte de miltefosina e diferenças nas taxas de efluxo/metabolismo, fitness e compartimentalização de fármacos não apresentaram um padrão que pudesse ser correlacionado à diferença de susceptibilidade ao fármaco. Com o objetivo de ampliar a busca por mecanismos de modulação da suscetibilidade à miltefosina nestes isolados, obtivemos o sequenciamento dos transcriptomas, que revelou a presença de 36 genes diferencialmente expressos entre os isolados polares. Dentre eles observamos um aumento na abundância do mensageiro que codifica a proteína Ros3 no isolado mais suscetível. Essa proteína compõe o complexo transportador MT-Ros3, considerado como a principal via de entrada de miltefosina em Leishmania. Portanto, as diferenças na suscetibilidade e absorção de miltefosina poderiam estar relacionadas à abundância de Ros3. Demonstramos que a abundância de mRNA Ros3 e o número de cópias do gene eram maiores no isolado mais sensível. Para a validação funcional do papel da dosagem gênica de Ros3 na diferença de suscetibilidade à miltefosina utilizamos duas abordagens, a superexpressão de Ros3 no isolado menos sensível à miltefosina e em L. (L.) major e o nocaute parcial e completo deste gene em L. (L.) major. Observamos um aumento de pelo menos 40 vezes na abundância de mRNA de Ros3 nos superexpressores. No entanto, não houve redução significativa na EC50 desses parasitas para miltefosina. A deleção parcial ou completa deste gene, por sua vez, resultou em um aumento significativo de 3 e 20 vezes, respectivamente, na EC50 de L. (L.) major para miltefosina, validando a participação da proteína Ros3 na expressão do fenótipo de suscetibilidade à miltefosina. Em conclusão, mostramos que variabilidade na suscetibilidade à miltefosina ocorre entre isolados clínicos de L. (L.) braziliensis independentemente de exposição prévia ao fármaco. Mostramos ainda que um dos fatores implicados nesse fenótipo é a modulação da abundância de Ros3 ao mesmo tempo que evidenciamos que essa proteína não é a única responsável pela suscetibilidade dos parasitas.