Construção de um vetor para transformar levedura através da disrupção do gene CAN1. - Camargo, Maria Evangelina de (1994)
Para a transformação tradicional da levedura Saccharomyces cerevisiae são empregadas cepas hospedeiras que devem necessariamente conter um marcador de auxotrofia, de forma que as células transformadas possam ser selecionadas posteriormente por complementação gênica. Em nosso trabalho construímos um vetor, que dispensa a necessidade destas marcas de auxotrofia, permitindo transformar cepas de leveduras selvagens e, portanto, até mesmo algumas cepas de interesse industrial. Este vetor é composto por um cassete de expressão de interesse (promotor, gene estrutural e terminador) ladeado por dois fragmentos do gene CAN1 de S. cerevisiae. Uma vez que as extremidades deste fragmento, são homólogas às sequências do gene CAN1 da levedura a ser transformada, este irá causar a disrupção genética na região homóloga. Por sua vez, o gene CAN1, quando funcional, é responsável pela permease do aminoácido arginina. Este aminoácido é análogo à canavanina, que entra na célula pelo mesmo mecanismo da arginina, e é uma droga com efeito letal à S. cerevisiae. Após a introdução deste novo vetor, a célula torna-se resistente à canavanina, por impedir a entrada de arginina e, consequentemente de canavanina na célula, permitindo a seleção dos transformantes e mantendo a informação genética adicional clonada 100% estável. Em nosso trabalho, para analisar esta proposta, empregamos o cassete de expressão em que a sequência sinal e estrutural da glicoamilase encontram-se clonadas sob a regulação das sequências promotoras e terminadoras da PGK de S. cerevisiae. Obtivemos sucesso na transformação, tanto de uma cepa de laboratório com marcas auxotróficas, como de células de cepas selvagens, sem nenhuma marca de auxotrofia , utilizadas em processos industriais, FTPT e HTYM-81 que originalmente são sensíveis à canavanina.