Estudo das bases moleculares de reações de transglicosilação em β-glicosidases GH1 de Spodoptera frugiperda eTenebrio molitor - Frutuoso, Maira Artischeff (2011)
Glicosídeos essenciais a vida podem ser sintetizados por métodos enzimáticos com altíssima especificidade. O mecanismo de reação de β-glicosidases GH1 por dupla-substituição envolve a formação de intermediário covalente (glicosil-enzima) que pode seguir duas rotas. Uma envolve sua hidrólise na ligação β-glicosídica entre glicone e aglicone do substrato, liberando o monossacarídeo da extremidade não-redutora; enquanto na outra rota, transglicosilação ou síntese por controle cinético, o intermediário é atacado por um aceptor glicosídico (2ª molécula de substrato), gerando um novo glicosídeo. BglB possui resíduos (W e H) que formam um \"canal\" por onde a água ataca o intermediário covalente no sítio ativo, sendo alvos de potenciais mutações que alteram o balanço entre as rotas e ampliando a eficiência de transglicosilação. Para caracterizar as bases moleculares da razão entre essas duas rotas catalíticas, β-glicosidases da família GH1 Spodoptera frugiperda (Sfβglu; AF052729) e Tenebrio molitor (Tmβglu; AF312017) foram produzidas como enzimas recombinantes em leveduras Pichia pastoris GS115, concentradas com 90% (p/v) de sulfato de amônio e diálise reversa com PEG 10000, e dialisadas em tampão CP 100 mM pH 6. A pureza foi confirmada por banda única com tamanho semelhante a 50 kDa (Sfβgly) e 56 kDa (Tmβgly) em SDS-PAGE. A atividade recuperada após purificação é 152% (Sfβgly) e 171% (Tmβgly) e a concentração protéica de 0,134 µg/µL (Sfβgly) e 0,217 µg/µL (Tmβgly). A razão entre as reações de hidrólise e transglicosilação (vH/vT) foi analisada utilizando os substratos pNPβ-gluco (0,1 mM a 8 mM) e MUβ-gluco (0,1 mM a 40 mM), a partir da velocidade de formação dos produtos pNP ou MU e glicose, respectivamente. Tmβgly catalisa reações de transglicosilação com ambos, mas vH/vT depende da [S] variando de +∞ (vH>>vT) a 1,5 para pNPβ-gluco e +∞ a 1 para MUβ-gluco. Sfβgly, ao contrário, não transglicosila com substrato MUβ-gluco. Além disso, vH/vT para pNPβ-gluco é 2 e independe da [S]. Já Sfβgly K201F conjuga propriedades de ambas, pois não transglicosila com MUβ-gluco, mas para pNPβ-gluco há ocorrência de transglicosilação dependente da [S], variando de +∞ (vH>>vT) a 1,25. Os parâmetros cinéticos (Vmax e Km) foram ajustados no Enzifitter e por simulação numérica na equação do modelo cinético ping-pong para dois substratos, e mostram maior (Km2) em Tmβgly e Sfβgly K201F do que em Sfβgly. Também foi avaliado o efeito da adição de aceptores alternativos que substituem a água em ensaios com pNPβ-gluco 4mM na presença de alcóois. Para as três enzimas a adição de metanol torna a vglc menor do que de vpNP, indicando ocorrência de transglicosilação. Com adição de n-propanol vH/vT diminui cerca de 7 vezes em Sfβgly e 2 vezes em Tmβgly. Os efeitos destes alcoóis sobre Sfβgly são maiores do que para Tmβgly e Sfβgly K201F, sugerindo acesso mais fácil destes ao intermediário covalente em Sfβgly, indicando diferenças entre as enzimas na configuração desta região. Portanto, notamos que vH/vT não está ligada à afinidade pela segunda molécula de substrato, podendo ser modulada por mutação do resíduo K201 de Sfβgly, posição relacionada ao acesso da água ou aceptor alternativo ao sítio ativo.