Obtenção de GFP5-scFv recombinante reativo à LDL(-): possíveis aplicações na investigação da aterosclerose - Guilherme, Daniel Ferreira (2012)
A aterosclerose é a doença de base das principais complicações cardiovasculares. Os produtos de modificação das lipoproteínas de baixa densidade, como a subfração eletronegativa LDL (-), exercem um importante papel na progressão da aterosclerose. O objetivo do presente trabalho foi expressar a proteína de fusão, GFP5-scFv anti-LDL (-), desenvolver um método para detecção de LDL (-), assim como avaliar a possível utilização desta proteína como uma ferramenta para monitorar os ensaios de formação de células espumosas. A proteína GFP5-scFv anti-LDL (-) foi expressa em E. coli BL21DE3. Esta proteína de fusão foi desnaturada com 7M de ureia, purificada por cromatografia de afinidade e reenovelada por gradiente de diálise na presença de poliestireno sulfonado. A massa molecular da proteína foi confirmada por SDS-PAGE e sua afinidade de ligação à LDL (-) confirmada pelo dot blot e ELISA. O espectro de emissão de fluorescência da GFP5-scFv anti-LDL (-) é qualitativamente equivalente ao da GFP5, porém com intensidade de emissão mais baixa. Na tentativa de superar essa limitação tentou-se realizar a inserção de um peptídeo ligante flexível entre os domínios de ligação da GFP5 e do scFv anti-LDL (-) para melhorar a eficiência de emissão de fluorescência da quimera. Os ensaios in vitro com macrófagos RAW 264.7 demonstraram que a GFP5-scFv anti-LDL (-) não apresentou toxicidade significante e não reduziu a captação de LDL (-) pelos macrófagos. Demonstrou-se por microscopia confocal, que a GFP5-scFv anti-LDL é internalizada pelos macrófagos e pode ser visualizada no interior destas células. Portanto, a proteína recombinante GFP5-scFv anti-LDL (-) é uma ferramenta que poderá ser utilizada em ensaios in vitro com macrófagos para o estudo da aterosclerose.