Sequências, propriedades e função de β-1,3-glucanases de insetos

• Autor(a) principal: Bragatto, Ivan
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-04112011-092208/
• topic: Beta-glucana; Beta-glucana; Beta-glucanase; Beta-glucanase; Carbohydrate; Carboidrato; Digestão; Digestion; Insect; Inseto

β-1,3-glucanases são enzimas encontradas em muitos organismos, como fungos, bactéria e plantas. Suas funções incluem remodelamento de parede celular, defesa e digestão. É um alvo interessante para o controle populacional de insetos-praga, porque é ausente em vertebrados. Em insetos, é encontrada no intestino de muitas ordens diferentes, e hidrolizam β-1,3 ou β-1,3(4)-glucanas ingeridas, mas pouco se sabe sobre as propriedades e a função dessas enzimas. Nós estudamos três espécies de insetos, de três ordens diferentes. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera), Tenebrio molitor (Coleoptera) e Abracris flavolineata (Orthoptera) são insetos herbívoros e pestes de plantações, mas suas beta-1,3-glucanases diferem significativamente. A β- 1,3-glucanase de S. frugiperda (SLAM) foi purificada do intestino médio da larva. Ela apresenta uma massa molecular de 37,5 kDa, um pH ótimo alcalino de 9,0, é ativa contra β-1,3-glucana (laminarina), mas é incapaz de hidrolizar β-1,3-1,6-glucana de levedura ou outros polisacarídeos. SLAM é não-processiva (0,4), e não é inibida por altas concentrações de substrato. Diferente de outras β-1,3-glucanases digestivas de insetos, SLAM é incapaz de lisar células de Saccharomyces cerevisae. O cDNA correspondente à SLAM foi clonado e sequenciado, demonstrando que a proteína pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases. A modelagem tridimensional de SLAM, feito com base em homologia de sequência, sugere que o resíduo E228 possa afetar a ionização dos resíduos catalíticos, causando o deslocamento do pH ótimo da enzima. Anti-corpos específicos para SLAM foram produzidos, e estes reagem com uma única proteína oriunda do intestino médio da larva, responsável pela atividade β-1,3- glucanásica majoritária. A imunocitolocalização de SLAM demonstra que a enzima é encontrada em vesículas secretórias e no glicocálix das células colunares, e portanto não é originária de simbiontes. Nós clonamos e sequenciamos o cDNA correspondente à β-1,3-glucanase majoritária presente no intestino médio da larva de T. molitor (TLAM). Ela pertence à família 16 das Glicosídeo-Hidrolases e está relacionada com proteínas ligantes de β -glucanas, da mesma forma que a enzima de S. frugiperda. A modelagem tridimensional por homologia de sequência permitiu identificar alguns resíduos de amino-ácidos (E174, E179, H204, Y304, R127 e R2181) no sítio ativo da enzima, que podem ser importantes para a atividade de TLAM. A β-1,3-glucanase digestiva do gafanhoto Abracris flavolineata (Orthoptera) é diferente das enzimas já estudadas em insetos. Ela apresenta uma estratégia catalítica processiva, liberando glicose como maior parte dos produtos, e é inibida por altas concentrações de substrato. Para estudar as bases estruturais desse mecanismo, nós procuramos obter a sequência de cDNA correspondente à enzima já caracterizada. O alinhamento múltiplo das β-1,3- glucanases de insetos e proteínas ligantes de beta-glucanas indicou que uma duplicação gênica da enzima do ancestral comum de moluscos e artrópodes. Uma cópia originou as beta-1,3-glucanase de insetos, perdendo uma região N-Terminal com cerca de 100 pares de bases, enquanto a outra cópia originou as proteínas ligantes de beta-glucana, perdendo os resíduos catalíticos.