Perfil de expressão plasmática dos microRNAs miR-200c e miR-210 em pacientes portadores de diferenças do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY de causa indeterminada

• Main Author: Elias, Felipe Martins
• Publication Date: 2020
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Download full: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5135/tde-22072021-142734/
• topic: Diagnosis.; Diagnóstico; Disorder of sex development 46XY; Hipospádia; Homeobox 1 de ligação a e-box em dedo de zinco; Hypospadias; MicroRNAs; MicroRNAs; post-transcriptional; Processamento pós-transcricional do RNA; RNA processing; Transtornos 46 XY do desenvolvimento sexual; Zinc finger e-box-binding homeobox 1

Introdução: As diferenças do desenvolvimento sexual (DDS) afetam 1:1000-4500 nascidos vivos e são definidos como alterações nas quais o desenvolvimento cromossômico, gonadal ou genital são atípicos. Os pacientes portadores de DDS 46,XY apresentam um amplo espectro fenotípico e muitos apresentam genitália atípica ao nascimento. A avaliação diagnóstica de um paciente portador de DDS inclui dosagens hormonais, estudos radiológicos, citogenéticos e moleculares. Porém, uma porcentagem significativa de pacientes permanece sem etiologia e são classificados como DDS de causa indeterminada. Este fato sugere que mecanismos epigenéticos, i.e., não restritos ao DNA e, portanto, não contemplados por análises moleculares usuais, como sequenciamento tipo Sanger e Exoma, possam desempenhar um papel no seu desenvolvimento. Objetivos: Para melhor avaliar estes casos sem diagnóstico estabelecido, investigou-se neste projeto o perfil de expressão plasmático de microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes de proteína, que se ligam por complementariedade a região 3 ?UTR de mRNA alvos, bloqueando a síntese proteica. Metodologia: Após análise in silico e da literatura os miRNAs, miR-200c, miR-210, e referências miR-23a e miR-451 foram selecionados. O RNA foi extraído do plasma de pacientes e controles, após análise de hemólise por absorbância em 414nm, com o kit MagMAX mirVana Total RNA (Thermofisher), a reação de RT-qPCR foi realizada com os kits TaqMan Advanced miRNA cDNA e Advanced miRNA Assay (Thermofisher). Os dados foram analisados por ?Ct e 2-??Ct. Pacientes e controles foram divididos em dois grupos, pré-púberes (de acordo com volume testicular <3ml e nível de Testosterona <30ng/dL) e, pós-púberes. Adicionalmente, os pacientes foram subdivididos em 2 subgrupos de acordo com o Escore de Masculinização da genitália Externa (EMS), em pouco virilizados (PVG, índice <5) e moderadamente virilizados (MVG, índice >5). Para análise de expressão por faixa etária os controles foram agrupados da seguinte maneira: 1-12 anos, 13-20 anos, 21-30 anos, 31-40 anos e 41-55 anos. Resultados: A expressão plasmática de miR-200c foi maior nos grupos de 13-20 a 41-55 anos do que no grupo de 1-12 anos (ANOVA p=0.0067). Adicionalmente, todos os grupos com mais de 13 anos tiveram médias individualmente maiores de miR-200c do que o grupo de 1-12 anos (p<0.05). A análise ANOVA dos grupos pós-púberes PVG, MVG e controles mostrou uma significância estatística p=0.0013, revelando uma expressão diferencial de miR-200c entre esses grupos. Em pós-puberes uma maior média de expressão de miR-200c foi observada em MVG, com pós-teste de Tukey entre MVG e PVG de p=0.01. Pacientes pós-púberes tiveram maior expressão de miR-200c do que os pacientes pré- púberes (p=0.0002). Os pacientes pós-púberes PVG apresentaram valores de expressão de miR- 200c semelhantes aos dos controles e DDS 46,XY pré-púberes. Em relação ao miR-210, a análise ANOVA de pós-púberes PVG, MVG e controles mostrou significância estatística de p=0.005, com MVG e PVG apresentando médias de expressão superiores ao grupo controle (p=0.002). O mesmo padrão foi observado em relação ao grupo pré-púberes (p=0.022). Conclusão: Em vários tecidos, uma alça de retrocontrole negativo, no qual o miR-200c inibe a expressão de ZEB1 foi demonstrado e foi associado à modulação da transição epitelial- mesenquimal (EMT). Níveis elevados de ZEB1 associado a baixos níveis de miR-200c foram observados na pele genital de indivíduos adultos do sexo masculino e de ratos com hipospádia, reforçando um papel potencial do miR-200c no desenvolvimento da hipospádia. Nossas descobertas fornecem novas evidências sobre o miR-200c circulante, que pode representar uma nova estratégia para a pesquisa em DDS 46,XY, e contribuir para uma maior compreensão do processo de desenvolvimento da genitália externa masculina.