Avaliação da incidência de Pythium insidiosum às margens do rio Tietê na região de Botucatu/SP e possíveis fatores ambientais associados - Camargo, Gabriel Gasparini (2023)
Os oomicetos são microrganismos do Reino Stramenipila, filogeneticamente próximos das algas e diatomáceas, e que apresentam características semelhantes aos fungos, como nutrição heterotrófica, crescimento vegetativo em forma de hifas e papéis ecológicos. Representante dos oomicetos, Pythium insidiosum é o agente etiológico da pitiose, uma doença capaz de acometer várias espécies de animais, tendo sido relatada em diferentes países, com maior número de casos em estações chuvosas. Os zoósporos, forma infectante dos oomicetos, são liberados em meio aquático e possuem motilidade que permite a busca por substratos vegetais ou queratinosos, por possuir quimiotaxia positiva para ambos. Apesar do conhecimento sobre o ciclo de vida de P. insidiosum, fatores ambientais limitantes e facilitadores para estabelecimento do patógeno no ambiente são pouco compreendidos. A detecção e isolamento de P. insidiosum do ambiente por métodos convencionais, como de iscagem e uso de meios de cultura seletivos, são pouco efetivos devido sua baixa sensibilidade, enquanto que técnicas moleculares são mais eficientes na detecção do patógeno no ambiente. O objetivo do projeto é identificar e monitorar a incidência de P. insidiosum às margens do rio Tietê na região de Botucatu/SP e caracterizar os ambientes quanto a incidência do patógeno por meio do levantamento de fatores ambientais possivelmente associados ao seu estabelecimento no ambiente. Para tanto, coletas de água foram realizadas em coluna d’água de ± 10cm de profundidade, em duplicata, e acondicionadas em frascos âmbar. Para realização do isolamento convencional, foi feita coleta de água em frascos contendo fragmento de ecdise de serpente, previamente esterilizados, e o conjunto armazenado em 35ºC por 24h. Após a incubação, a isca foi transferida para meio de cultura seletivo para P. insidiosum e observada por até 10 dias. Para filtragem, foi coletada água nos mesmos locais, em duplicata, a qual foi armazenada em gelo para transporte e posterior filtragem. O processo de filtração para obtenção de environmental-DNA (eDNA), foi feito com auxílio de bomba a vácuo, em filtro NCE (nitrate cellulose) com poros de 0,45 µm. O conteúdo do filtrado foi extraído utilizando protocolo in house CTAB adaptado. A detecção do patógeno nas amostras extraídas foi feita por PCR convencional (cPCR), nested PCR utilizando primers específicos para P. insidiosum (Pi1 e Pi2) e os amplicons revelados por eletroforese em gel de agarose. Também foi aplicada técnica de PCR em tempo real (qPCR) utilizando os mesmos primers. A temperatura e pH da água foram aferidos in loco. O índice de precipitação pluviométrica, com intervalo de 15 dias anteriores à data de coleta, foi obtido em base de dados de estações meteorológicas, administradas por órgãos como INMET (Instituto Nacional de Metereologia) e CIIAGRO (Centro Integrado de Informações Agrometereológicas). Do total de 20 pontos amostrados, foi detectada presença de material genético do patógeno em 5 (25%), por meio de técnica molecular, enquanto que por método convencional foi registrado um isolamento (2,5%). Amostras positivas foram obtidas em água com diferentes temperaturas, com amplitude térmica de 11ºC. Entre os locais amostrados, o pH apresentou variação entre 5,3 e 6,8, sendo a maioria caracterizado como levemente ácido. Em todos pontos em que foi detectada presença de material genética do patógeno houve registro de pluviosidade e presença de vegetação imediatamente próximas aos pontos de coleta, sobretudo representantes da família Poaceae (gramíneas). Os resultados indicam uma tendência na detecção e presença de P. insidiosum mesmo em água com temperatura amena. Ambientes com altas temperaturas são tidos como condição favorável para desenvolvimento do microrganismo e alta produção de zoósporos, no entanto houve um isolamento de P. insidiosum em temperatura amena (21°C), sugerindo versatilidade quanto sua dispersão no ambiente. Métodos moleculares podem ser uma alternativa de alta eficácia para detecção do patógeno em áreas de risco.