Estudo do impacto da função do Fator de Início de Tradução de Eucariotos (eIF5A) no perfil proteômico celular utilizando o modelo de Saccharomyces cerevisiae - Barbosa, Natália Moreira [UNESP] (2019)
O fator de início de tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A sofre uma modificação pós-traducional exclusiva e essencial para sua função, em que um resíduo específico de lisina é convertido em uma hipusina. Apesar eIF5A já ter sido relacionado com o início da tradução, uma quantidade crescente de estudos recentes têm estabelecido sua função na etapa de elongação da tradução, mais especificamente na elongação de sequências que são capazes de induzir um stalling (atraso ou parada) do ribossomo. Entretanto, existem ainda poucos trabalhos realizados com perfil proteômico na ausência de função de eIF5A, de maneira que atualmente pouco se sabe sobre as proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A. Desta forma, o presente projeto visa a busca de proteínas que têm sua tradução dependente de eIF5A através da comparação de perfil proteômico entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A em Saccharomyces cerevisiae. Para isto, utilizamos neste trabalho uma estratégia de perfil proteômico celular in vivo por fluorescência de GFP utilizando uma coleção de 4.156 linhagens, cada uma contendo uma ORF diferente em fusão com GFP no C-terminal, e uma proteína RFP (variante E2Crimson) constitutivamente produzida como normalizador, tanto no background selvagem (HYP2) como mutante para eIF5A (hyp2-3). Esta tese apresenta a análise dos dados de GFP/RFP e a validação desta análise utilizando-se western blot. Os resultados demonstram um grupo de proteínas diferencialmente menos produzidas, das quais a maioria se relaciona com processos mitocondriais. Para confirmar o envolvimento de eIF5A com função mitocondrial, caracterizou-se a fisiologia mitocondrial em mutantes de eIF5A. Revelou-se a incapacidade de crescimento do mutante de eIF5A em fontes de carbono não fermentáveis, ou seja, que dependem da mitocôndria para sua oxidação. O mutante de eIF5A também apresentou atividade respiratória reduzida, aumento no potencial de membrana e na quantidade de DNA mitocondrial, embora a morfologia não pareça estar afetada. Majoritariamente, as proteínas mitocondriais são codificadas no núcleo, traduzidas no citoplasma e importadas para mitocôndria como um polipeptídio desenovelado ou então são translocadas de maneira cotraducional para mitocôndria, e, de alguma maneira, eIF5A pode estar regulando a tradução dessas proteínas especificamente. Interessantemente, a desaceleração das taxas de elongação da tradução por códons raros ou outras sequências causadoras de parada ou atraso na tradução podem facilitar a ligação de Partícula Reconhecedora de Sinal (SRP) ao ribossomo, o que pode interferir com o direcionamento ao RE. Assim, existem diferentes caminhos pelos quais eIF5A poderia interferir com a tradução de proteínas direcionadas à mitocôndria ou ao RE e trabalhos futuros são necessários para abordar os mecanismos subjacentes ao papel de eIF5A na célula.