Estudos estruturais com a importina-α do fungo Neurospora crassa e peptídeos de sequências de localização nuclear (NLS) de proteínas relacionadas ao metabolismo de fungos - Bernardes, Natália Elisa [UNESP] (2018)
A comunicação entre o núcleo celular e o citoplasma acontece através de mecanismos de transporte que permitem a passagem de moléculas por poros presentes no envoltório nuclear. Na Via Clássica de Importação Nuclear, a proteína Importina-α (Impα) atua na identificação das proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). Os primeiros estudos de caracterização estrutural da Impα de Neurospora crassa (NcImpα) e a sua estrutura cristalográfica mostraram a presença de regiões que podem estar relacionadas a especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs de proteínas de fungos. Além disso, foram reconhecidos prováveis NLSs em proteínas reguladoras do metabolismo de carbono e nitrogênio em fungos. O objetivo desse trabalho é identificar e caracterizar o modo de interação de NLSs de proteínas fúngicas com a NcImpα e verificar possíveis especificidades da proteína NcImpα no reconhecimento de NLSs. Os potenciais peptídeos NLS de proteínas dos fungos filamentosos N. crassa e Aspergillus nidulans foram submetidos a experimentos de calorimetria de titulação isotérmica (ITC) com a proteína NcImpα, para calcular a afinidade entre as moléculas. Dentre os peptídeos testados, as sequências correspondentes ao potenciais NLS dos fatores de transcrição PAC-3, NIT-2, FLB-3, VOSA e VEA, apresentaram elevada afinidade com a NcImpα, conforme indicado pelos valores de Kd obtidos. Quando submetidos a experimentos de importação nuclear,o peptídeo NIT2-NLS foi eficientemente transportado para o interior do núcleo celular. Foram realizados testes de cristalização para a elucidação da estrutura dos complexos Impα/peptídeos NLS. O conjunto de dados do complexo NcImpα/NIT2NLS a 2,50 Å de resolução, permitiu a elucidação da estrutura onde foi possível observar a presença do peptídeo NIT2-NLS nos sítios principal e secundário de NcImpα. Já a estrutura do complexo MmImpα/PAC3-NLS mostrou o peptídeo se lihando com maior afinidade apenas ao sítio prinicpal. A comparação das sequências dos peptídeos VEA-NLS e VE1-NLS mostrou que a substituição de um resíduo de lisina por uma leucina e uma lisina por uma arginina nas posições P1’ e P2 é suficiente para reduzir drasticamente a afinidade do peptídeo VE1-NLS pela NcImpα. Por fim, se sugere que o peptídeo VOSA-NLS se liga a NcImpα em uma conformação muito semelhante ao peptídeo NIT2-NLS e as NLSs da proteína FLB3-NLS podem apresentam afinidade a apenas um dos sítios da proteína NcImpα.