Peptídeo-conjugados derivados da toxina ParE: design, síntese e estudos biológicos - Bedoya, Jose Gregorio Martin (2024)
O desenvolvimento de novos fármacos com ação antibacteriana e antitumoral requer a identificação de um alvo celular específico. Um grupo de moléculas que se tornou alvo celular efetivo para agentes terapêuticos é o das topoisomerases. As topoisomerases, são enzimas essenciais para os processos de replicação e transcrição do DNA e, portanto, para a viabilidade celular. Inúmeros agentes antibacterianos atuam inibindo a atividade destas enzimas, como as quinolonas, cumarinas, microcinas e toxinas bacterianas, tais como ParE e CcdB. ParE inibe a síntese de DNA agindo diretamente na ação de duas topoisomerases: DNA girase e topoisomerase IV. Peptídeos derivados de ParE têm sido descritos como inibidores de topoisomerases bacterianas in vitro e, portanto, agentes antibacterianos em potencial. No entanto, a baixa capacidade destes peptídeos em permear a membrana plasmática bacteriana impede o uso dos mesmos para fins terapêuticos. Para contornar esta limitação, decidiu-se neste trabalho, projetar e sintetizar peptídeo-derivados de ParE, conjugados com fluoroquinolonas e moléculas contendo grupos cumarínicos, e avaliar a capacidade de inibir a atividade de diferentes topoisomerases bem como, em prevenir o crescimento bacteriano. Para isso, peptídeo-conjugados foram sintetizados pela metodologia de fase sólida, purificados e analisados por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizados por espectrometria de massas. Análise de dicroísmo circular revelou uma conformação predominante em folha-β nos peptídeos, e que as conjugações em ParELC3M não alteraram de forma significativa sua estruturação secundária. A capacidade de inibição destes compostos sobre a atividade das topoisomerases foi testada por ensaios de eletroforese em gel. Atividades antibacteriana e antifúngica avaliadas pelo método de microdiluição em caldo e a viabilidade celular pelo método de MTT. Um peptídeo derivado de ParE (ParELC3M) e seus conjugados CFX-ParELC3M, CICPOQ-ParELC3M, HOCAc-ParELC3M e CFXPip-ParELC3M foram obtidos e testados. Tentativa de expressão da proteína ParE também foi realizada, objetivando a obtenção da toxina para estudos comparativos. Em ensaios padrão de superenrolamento e relaxamento do DNA, o peptídeo ParELC3M e seus conjugados, não inibiram completamente a atividade da DNA girase de E. coli e S. pneumoniae, mas inibiram a DNA girase de M. tuberculosis em concentrações entre 50 e 12,5 µmol.L-1. Por outro lado, todos peptídeo-conjugados inibiram a reação de relaxamento catalisada pelo topo IV de E. coli e S. pneumoniae com valores de IC100 entre 50 e 25 µmol.L-1. Adicionalmente, os peptídeo-conjugados CFX-ParELC3M e CFXPip-ParELC3M inibiram a topo IA de E. coli e Topo II de levedura com valores de IC100 menores que 6,25 µmol.L-1 e 3,125 µmol.L-1, respectivamente. Somente CFXPip-ParELC3M foi capaz de inibir o crescimento bacteriano, com um valor de MIC de 25 µmol.L-1. Mas em relação à atividade antifúngica, os peptídeos-conjugados não apresentaram inibição de crescimento de C. albicans. Estes resultados indicam que a conjugação de grupos fluoquinolônicos a peptídeos inibidores de topoisomerases, tal como ParELC3M, podem facilitar sua passagem através da membrana bacteriana para atingir seu alvo intracelular, as topoisomerases. Além disso, os peptídeo-conjugados não demostraram toxicidade em células MRC-5. Os resultados indicam que os conjugados derivados de ParE representam uma estratégia promissora para o desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos.