Estratégias para minimização do estresse oxidativo em sistemas de produção in vitro de embriões bovinos destinados à vitrificação - Rocha-Frigoni, Nathália Alves de Souza [UNESP] (2016)
O objetivo desse estudo foi avaliar diferentes estratégias para minimizar os efeitos do estresse oxidativo induzido pela menadiona durante o cultivo in vitro sobre o potencial de desenvolvimento embrionário in vitro. Para tanto, no Experimento I, os oócitos foram MIV em meio suplementado com 0,6 mM de cisteína e 100 µM de cisteamina (C+C), 100 UI de catalase (CAT), 0,6 mM de cisteína associado à 100 µM de cisteamina e 100 UI de catalase (C+C+CAT), ou sem a suplementação com antioxidantes (Controle). Posteriormente, foram fecundados e os prováveis zigotos cultivados in vitro durante 7 dias. Oócitos imaturos (0h) e após 22 h de MIV foram avaliados quanto ao conteúdo intracelular de ROS e de GSH, potencial de membrana mitocondrial, maturação nuclear e ocorrência de apoptose. No Experimento II, oócitos foram MIV em meio suplementado com C+C+CAT (ATX) e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF. Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos destinados às avaliações quanto ao conteúdo intracelular de ROS e GSH, atividade de caspases 3 e 7 e ocorrência de apoptose. Por fim, no Experimento III, oócitos foram MIV e os prováveis zigotos foram CIV em meio SOF suplementado com 100 ng/mL de IGF-I (IGF). Do Dia 6 até o final do CIV os embriões foram cultivados na presença ou ausência de 5 µM de menadiona (MD). No dia 7 foi avaliada a taxa de blastocistos e os mesmos foram destinados às avaliações previamente descritas no Experimento II além da avaliação da taxa de re-expansão após vitrificação/aquecimento e expressão dos genes CASP3, GPX-1 e SOD-1. No experimento I, a taxa de maturação nuclear não foi afetada pelos tratamentos (P> 0,05). A porcentagem de apoptose do grupo C+C+CAT foi superior (P<0,05) ao grupo CAT, porém os grupos Controle e C+C não diferiram dos demais (P>0,05). O conteúdo intracelular de ROS nos grupos C+C e C+C+CAT foi semelhante ao observado em oócitos imaturos (0h), e o maior (P<0,05) nível de ROS foi encontrado no grupo Controle. O conteúdo intracelular de GSH foi reduzido (P<0,05) em todos os grupos quando comparados aos oócitos imaturos, no entanto os grupos Controle, CAT e C+C+CAT apresentaram menores (P<0,05) concentrações de GSH quando comparado ao grupo C+C. O potencial de membrana mitocondrial aumentou em todos os grupos (P<0,05) comparado com os oócitos imaturos (0h), com exceção do grupo C+C. A taxa de blastocistos foi maior (P<0,05) no grupo C+C+CAT comparada aos demais grupos. No experimento II, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) aos observados nos grupos Controle e Controle ATX, já o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. A atividade de caspases não diferiu (P>0,05) entre os grupos. No entanto, as porcentagens de apoptose encontradas nos grupos MD e ATX MD foram superiores (P<0,05) comparadas aos grupos Controle e Controle ATX. A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e Controle ATX, porém o grupo ATX MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. No experimento III, o conteúdo intracelular de GSH foi similar (P>0,05) entre os grupos experimentais. O conteúdo intracelular de ROS encontrado no grupo MD foi superior (P<0,05) ao observado no grupo Controle, já os grupos IGF e IGF MD não diferiram (P>0,05) dos grupos anteriormente mencionados. Com relação à atividade de caspases 3 e 7 não houve diferença (P>0,05) entre os grupos. O número total de blastômeros não diferiu (P>0,05) entre os grupos experimentais. No entanto, as maiores porcentagens de apoptose foram encontradas no grupo MD e foram superiores (P<0,05) aos grupos Controle, IGF e IGF MD. Níveis intermediários de porcentagem de apoptose foram encontrados nos grupos Controle e IGF MD, que não diferiram entre si (P>0,05), porém tais grupos foram superiores (P<0,05) comparado ao grupo IGF, que apresentou as menores porcentagens (P<0,05). A taxa de blastocisto foi menor (P<0,05) no grupo MD comparados aos grupos Controle e IGF, porém o grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos demais grupos experimentais. A taxa de re-expansão foi inferior (P<0,05) no grupo MD comparada aos grupos Controle e IGF, que não diferiram entre si (P>0,05). O grupo IGF MD não diferiu (P>0,05) dos grupos IGF e MD, porém foi inferior (P<0,05) quando comparado ao grupo Controle. Não houve diferença (P>0,05) na expressão relativa dos genes CASP3 e GPX-1 entre os grupos experimentais. No entanto, a expressão do gene SOD-1 foi maior (P<0,05) no grupo IGF MD comparado ao grupo IGF, porém estes grupos não diferiram (P>0,05) dos grupos Controle e MD. Em conclusão, a suplementação com antioxidantes intra- e extracelulares durante a MIV melhorou a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário e minimizou os efeitos deletérios do estresse oxidativo induzido pela menadiona. Ainda, a adição de IGF-1 durante o CIV aumentou a resistência ao estresse oxidativo induzido pela menadiona, visto que aumentou a expressão do gene antioxidante SOD-1, o que resultou em redução da apoptose e melhorou o desenvolvimento e criotolerância de blastocistos bovinos.