Desenvolvimento e validação de marcadores microssatélites para o feijão-comum - Tanure, Janaína Paula Marques (2009)
O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura de destacada importância nutricional, econômica e social. Programas de melhoramento genético do feijoeiro têm utilizado marcadores moleculares como importantes ferramentas auxiliares em diversos tipos de estudos genéticos. Diferentes classes de marcadores têm sido desenvolvidas, dentre as quais se destacam os microssatélites. Os microssatélites (SSR) são seqüências simples repetidas de DNA, que se repetem em tandem ao longo do genoma, formando sítios altamente polimórficos, o que possibilita o seu uso como marcas moleculares. Como marcadores, são codominantes, multialélicos, e aplicáveis em diversos tipos de estudos, principalmente no mapeamento genético. Primers que flanqueiam sequências SSR geralmente são desenhados a partir da construção de bibliotecas genômicas, bibliotecas genômicas enriquecidas, sequências depositadas em bancos de dados e, alternativamente, a partir de seqüências internas simples repetidas (ISSR). Geneticistas moleculares têm desenvolvido marcadores SSR com o intuito de mapear genes que codificam determinadas características de interesse. Entretanto, não existe um mapa consenso saturado para o feijão que sirva como referência para auxiliar na construção de mapas específicos. Nesta perspectiva, o Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV desenvolveu uma população de RIL s que poderá ser usada para integrar, em um único mapa, todos os marcadores SSR já desenvolvidos. No entanto, para a saturação do mapa, há necessidade de um grande número de marcadores. O presente trabalho teve o objetivo de desenvolver e validar primers que amplifiquem regiões contendo microssatélites a partir da metodologia da construção de bibliotecas genômicas enriquecidas e a partir de ISSR. Na primeira metodologia, em trabalho anterior, foram construídas duas bibliotecas genômicas enriquecidas para seqüências SSR. No presente trabalho, a partir das bibliotecas genômicas desenvolvidas, foram selecionados 207 clones contendo insertos de tamanho desejado. Destes, foram seqüenciados 196 (94,68%), dos quais 184 (88,89%) puderam ser analisados, sendo 133 clones da biblioteca 1 e 51 da biblioteca 2. Foram detectados 48 (26,09%) clones redundantes. A análise dos clones permitiu identificar 66 (49,62%) motivos SSR na biblioteca 1 e 20 (39,22%) na biblioteca 2, a partir dos quais foram desenhados 56 pares de primers. Destes, 34 tiveram suas condições de amplificação otimizadas e padronizadas e foram testados quanto ao polismorfismo detectado entre 20 genótipos andinos e mesoamericanos, incluindo os genitores AND277 e Rudá. Todos os primers geraram produtos de amplificação e seis (17,65%) amplificaram produtos polimórficos entre os genótipos testados. Em relação à metodologia de enriquecimento por ISSR-PCR foram selecionados 250 clones contendo insertos com tamanho desejado, obtidos a partir da amplificação por ISSRPCR, clonagem dos fragmentos e transformação de células competentes. Dos 250 clones, 168 (67,2%) foram sequenciados e 103 (41,2%) puderam ser analisados. Foram detectados 30 clones redundantes (29,13%). A análise das sequências permitiu identificar 58 motivos microssatélites (56,31%) e foi possível o desenho de 32 pares de primers. Destes, 10 tiveram suas condições de amplificação padronizadas e foram analisados quanto ao polimorfismo detectado entre os mesmos 20 genótipos andinos e mesoamericanos utilizados na metodologia de bibliotecas genômicas enriquecidas. Dos 10 pares de primers testados, seis comportaram-se como marcadores codominantes e quatro como dominantes. Dos codominantes nenhum mostrou-se polimórfico dentre os genótipos testados. Adicionalmente, as sequências contendo motivos microssatélites, obtidas a partir das duas metodologias utilizadas, foram submetidas à busca por similaridade com sequências já caracterizadas em bancos públicos de sequências. Foi identificada similaridade com regiões transcritas e não traduzidas, e com regiões codificadoras de proteínas, a partir do genoma nuclear, mitocondrial e do cloroplasto, e também a partir de sequências advindas de retrotransposons. As duas metodologias utilizadas foram eficazes para a seleção, no feijoeiro, de seqüências contendo microssatélites. Estes resultados representam um primeiro esforço no sentido de selecionar marcadores moleculares que serão futuramente mapeados na população consenso de RILs, além de fornecer marcadores que poderão ser usados nos mais variados tipos de estudos genéticos, contribuindo de fundamental maneira para o aprimoramento dos programas de melhoramento do feijoeiro comum que utilizam marcadores moleculares.