Estudo da atividade de mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) em substratos celulósicos por espectromeria de massas - Teixeira, Tallyta Santos (2018)
As mono-oxigenases líticas de polissacarídeos (LPMOs) são enzimas acessórias que auxiliam a ação de enzimas hidrolíticas na desconstrução da parede celular vegetal. O sinergismo dessas enzimas facilita a obtenção de monômeros de açúcares que são fundamentais para o metabolismo microbiano e para processos industriais. A caracterização das LPMOs é desafiadora, pois ela atua na celulose e em outros polissacarídeos através de clivagem oxidativa, resultando em diferentes tipos de oligômeros. Por isso, se faz necessário utilizar técnicas analíticas avançadas como a espectrometria de massas que permite a identificação de compostos químicos a partir da relação m/z (massa-carga). Dessa forma, este trabalho teve como objetivo avaliar a ação da LPMO de Thermobifida fusca (TfAA10) recombinante em substratos celulósicos por espectrometria de massas. Duas construções gênicas foram avaliadas quanto à atividade de LPMO: 1) TfAA10-O (com códon otimizado) e 2) TfAA10-N (com códon nativo), sendo expressas em Khomagatella phaffi (Pichia pastoris). A TfAA10-O foi produzida em erlenmeyer (250 mL), enquanto que a TfAA10-N em erlenmeyer (250 mL) e biorreator (1 L). Os perfis destas enzimas foram analisados por MALDI-TOF MS, empregando ácido sinapílico e modo linear positivo, no qual observou duas isoformas, ou seja, duas proteínas que a partir da mesma sequência, possuem tamanhos moleculares diferentes (27 e 24 kDa). As atividades das LPMOs foram avaliadas em substratos celulósicos (Avicel PH101 e PASC), tendo o ácido ascórbico como doador de elétrons, e controles na presença e ausência de enzima e/ou ácido ascórbico. As condições reacionais e os métodos analíticos foram otimizados para permitir a análise dos produtos da reação enzimática. Dentre as condições reacionais avaliadas tem-se: tampões, concentrações de enzima e de ácido ascórbico, agitação, forma de purificação e substrato. O método analítico por MALDI-TOF MS foi otimizado quanto aos parâmetros instrumentais e ao método de preparo da amostra, já o método LCMS foi desenvolvido com base na literatura e otimizado com padrões de oligossacarídeos. Mesmo após a otimização dos métodos, em nenhuma das condições testadas foi possível detectar oligossacarídeos oxidados que confirmem a ação das LPMOs estudadas. Apesar disso, diversas informações foram relevantes para o estudo da ação dessas enzimas. Quanto as condições reacionais, os tampões de potássio se mostraram inviáveis para análises de hidrólise de LPMOs pela possibilidade de gerar falso-positivos, sendo indicados nestes casos os tampões de amônio ou sódio. Nas análises por MALDI-TOF MS, a adição de cloreto de sódio se mostrou adequada por permitir maior intensidade dos oligossacarídeos e também evitar a interpretação errônea de oligossacarídeos oxidados sodiados e não oxidados potassiados, que possuem mesmo valor m/z. O dopping de amostras contendo íons duvidosos com sais de lítio, potássio e/ou sódio podem auxiliar a revelar a identidade desses íons, permitindo verificar a presença de oligossacarídeos oxidados, em baixa concentração pela ação do ácido ascórbico, evidenciando assim a necessidade dos controles. A TfAA10-N produzida em biorreator apresentou oligossacarídeos nativos com menor grau de polimerização (DP2-DP4) ao longo dos tempos reacionais, nos tampões de acetato e de fosfato de sódio. Esse resultado foi observado em ensaios na presença da enzima (com e sem ácido ascórbico), quando analisada pelos dois métodos analíticos, sugerindo uma ação hidrolítica nas condições testadas. O método MALDI-TOF MS permitiu a análise de oligossacarídeos com maior grau de polimerização (DP3-DP9), enquanto o método UHPLC-ESI-MS mostrou adequado para oligossacarídeos menores (DP1-DP4) e também para análises de amostras mais complexas. Dessa forma, os métodos analíticos se mostraram ser complementares para a caracterização das LPMOs, podendo assim auxiliar no direcionamento das aplicações desta enzima. E este estudo mostrou que a TfAA10A expressa em K. phaffii não apresenta atividade em celulose (Avicel e PASC) provavelmente devido ao padrão de glicosilação que esta apresenta. Apenas oligossacarídeos nativos foram detectados, que podem estar relacionados à clivagem interna, mas que não são suficientes para comprovar a ação desta LPMO.