Caracterização da atividade cininogenásica no líquido pericárdico humano - CIELLO, Giani del (2015)
O líquido pericárdico está em contato com o coração e reflete seu status fisiológico. Durante os processos patológicos cardíacos, o nível de fatores bioquímicos no fluido pericárdico é significativamente alterado, sendo considerado um ótimo material para pesquisas cardiovasculares. Atividade de enzimas das classes de serino, aspartil e cisteíno peptidases já foram descritas no fluido pericárdico. Como estas classes enzimáticas têm sido incluídas como cininogenases, e a bradicinina exerce um importante papel de proteção do sistema cardiovascular pela sua potente ação vasodilatadora, a caracterização de atividade cininogenásica no fluido pericárdico é de grande interesse no entendimento dos processos de regulação do tônus vascular neste local. O objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade de enzimas presentes no líquido pericárdio gerar cininas. Vinte e três (23) amostras de fluido pericárdico humano, obtidas durante procedimentos cirúrgicos de revascularização coronária, cirurgia de aorta torácica e substituição valvar, foram analisadas quanto às atividades de aspartil, serino e cisteíno proteases. Para determinação das atividades enzimáticas foram utilizados os substratos sintéticos, com apagamento intramolecular de fluorescência, Abz-KPIEFFRLQ-Eddnp (suscetível à hidrólise por aspartil peptidases), Abz-AIKFFRLQ-Eddnp (suscetível à hidrólise por aspartil e cisteíno peptidases), Abz-MISLMKRPQ-Eddnp e Abz-FRSSRQ-Eddnp (sequências N e C terminais em torno da bradicinina), na faixa de pH de 2,0 a 9,0. Inibidores (Pepstatina A, PMSF e E-64) foram utilizados para caracterizar as classes enzimáticas. As hidrólises foram avaliadas através da variação de fluorescência. Os pontos de clivagem nos substratos com sequências do cininogênio foram monitorados através de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e da análise de aminoácidos dos fragmentos liberados. Todas as amostras de fluido pericárdico utilizadas neste estudo hidrolisaram os substratos testados. O pH ótimo de hidrólise dos peptídeos pelas enzimas do fluido pericárdico para cada um dos substratos foi 4,0 (Abz-KPIEFFRLQ-Eddnp, Abz-AIKFFRLQ-Eddnp, Abz-MISLMKRPQ-Eddnp e Abz-FRSSRQ-Eddnp), inibida pela Pepstatina A; 6,0 (Abz-AIKFFRLQ-Eddnp) inibida por E-64; e 8,0 (Abz-MISLMKRPQ-Eddnp e Abz-FRSSRQ-Eddnp) inibida por PMSF. Os resultados mostram que o fluido pericárdico humano hidrolisou os substratos relacionados ao cininogênio. Para o substrato Abz-MISLMKRPQ-Eddnp os dados obtidos foram 75±31µM.min-1( média ± DP) em pH ácido, e 334±161 µM.min-1( média ± DP) em pH 8,0. Os inibidores enzimáticos foram úteis para mostrar que aspartil e serino proteases são as classes enzimáticas com potencial atividade cininogenásica no fluido pericárdico. A análise cromatográfica dos peptídeos e de aminoácidos dos fragmentos liberados após as hidrólises permitiu observar que cada um dos substratos foi clivado em uma única ligação. Em pH 4,0 os produtos fluorescentes foram similares aos fragmentos obtidos da hidrólise por uma protease ácida renal que libera MLBK do cininogênio humano, com clivagem das ligações Leu-Met e Arg-Ser nos substratos Abz-MISLMKRPQ-Eddnp e Abz-FRSSRQ-Eddnp, respectivamente. Em pH 8,0 os produtos de hidrólise apresentaram tempos de retençao comparáveis aos obtidos para a calicreína plasmática e a hidrólise ocorreu nas ligações Lys-Arg e Arg-Ser para os mesmos substratos, sugerindo a liberação de bradicinina. Nas condições de ensaio utilizadas não foi possível identificar atividade cininogenásica relacionada a cisteíno peptidases. Nossos resultados mostram que o fluido pericárdico humano contém enzimas com potencial atividade cininogenásica, corroborando com outros estudos que sugerem que o conteúdo de peptídeos do fluido pericárdico não deve ser consequência apenas do fluxo do fluido intersticial miocárdico. Ainda não podemos afirmar se este fluido contém substratos para a atividade cininogenásica e se as cininas liberadas localmente tem significância fisiológica.