Efeitos das toxinas A e B do Clostridium difficile sobre a via de WNT/Beta-catenina em cÃlulas epiteliais intestinais - Bruno Bezerra Lima (2014)
As toxinas A e B do Clostridium difficile (TcdA e TcdB) sÃo glicosiltransferases homÃlogas que inibem um grupo de pequenas GTPases dentro da cÃlula hospedeira, contudo, vÃrios mecanismos envolvidos na atividade patogÃnica dessas toxinas permanecem desconhecidos. No presente estudo, avaliamos os efeitos das TcdA e TcdB na via de Wnt/Beta-catenina que representa a forÃa motora principal responsÃvel pela proliferaÃÃo das cÃlulas epiteliais nas criptas colÃnicas. Foram utilizadas cÃlulas IEC-6 (cÃlulas epiteliais de criptas de Rattus novergicus) e RKO (cÃlulas de adenocarcinoma de cÃlon humano). Estas cÃlulas foram estimuladas com meio condicionado contendo Wnt3a e incubadas com 10, 50 ou 100 ng/mL de TcdA ou 1, 5 ou 10 ng/mL de TcdB por 24h, resultando em uma inibiÃÃo dose-dependente da via de sinalizaÃÃo canÃnica de Wnt, como demonstrado pelo ensaio de repÃrter de fator de cÃlula T (TCF). Esse resultado foi corroborado pelos dados da imunofluorescÃncia com marcaÃÃo para a localizaÃÃo nuclear de Beta-catenina e por western blotting para Beta-catenina e c-MYC (gene-alvo da via de Wnt). AlÃm disso, os dados do experimento de western blot evidenciaram uma diminuiÃÃo dos nÃveis da proteÃna Beta-catenina, o qual foi prontamente revertido por z-VAD-fmk, um pan-inibidor de caspase. Entretanto, a TcdA ainda foi capaz de inibir a via de Wnt/Beta-catenina mesmo na presenÃa do z-VAD-fmk, cloreto de lÃtio (um inibidor de GSK3Beta) ou plasmÃdeo de Beta-catenina constitutivamente ativo, como determinado pelo ensaio do TCF (TOPFlash/Luciferase). O estudo evidenciou ainda que a prÃ-incubaÃÃo de cÃlulas RKO com TcdA por 12h tambÃm atenuou a ativaÃÃo da via de Wnt mediada por Wnt3a, o que sugere que a inativaÃÃo de RhoGTPases, particularmente Rac1, possui um papel nessa inibiÃÃo. Em conclusÃo, esses achados sugerem que a inibiÃÃo da via canÃnica de Wnt pelas TcdA e TcdB representa um mecanismo importante da sua patogÃnese e explica seus efeitos anti-proliferativos.