AnÃlise proteÃmica do plasma seminal e secreÃÃes do epidÃdimo em ruminantes: potenciais associaÃÃes com o desenvolvimento sexual, parÃmetros seminais e funÃÃo espermatica - Carlos Eduardo Azevedo Souza (2007)
Este trabalho se compÃe de trÃs estudos distintos, avaliando diferentes enfoques da composiÃÃo das proteÃnas expressas nos fluidos reprodutivos de ruminantes. O primeiro estudo descreve as variaÃÃes no perfil protÃico do plasma seminal de ovinos Santa InÃs. O segundo avalia as proteÃnas presentes no fluido da cauda do epidÃdimo de touros HolandÃs maduros. A terceira parte mostra detalhes da distribuiÃÃo topogrÃfica e intensidade de ligaÃÃo das BSPs e da osteopontina Ã membrana de espermatozÃides bovinos. No estudo 1, amostras de sÃmen de dezesseis cordeiros da raÃa Santa InÃs foram colhidas. As amostras foram centrifugadas para obtenÃÃo do plasma seminal. Um volume contendo 150 Âg de proteÃnas foi utilizado para a preparaÃÃo de gÃis bidimensionais, que foram digitalizados e analisados. A quantificaÃÃo das proteÃnas nos gÃis foi dada como PPM da densidade Ãptica total integrada de todas as proteÃnas, de acordo com o programa. Foram encontrados 186 Â 10 spots protÃicos nos gÃis oriundos de amostras coletadas Ãs 48 sem., semelhante ao encontrado Ãs 34 (183) e 30 (179) semanas de idade. Os mapas representando 34 e 48 semanas apresentaram uma seqÃÃncia de spots de 63 kDa (pI 4,2 a 5,0) que nÃo estava presente nas idades mais jovens. Ã medida que os animais amadureceram, novas proteÃnas foram detectadas no plasma seminal. Nos mapas de 20 semanas de idade, seqÃÃncias de elevada massa molecular (158 a 160 kDa) foram detectadas, diferentemente dos mapas obtidos em idades mais jovens. MudanÃas quantitativas na secreÃÃo dos spots em funÃÃo da idade foram mais evidentes durante a fase prÃ-pÃbere. Detectaram-se tambÃm relaÃÃes entre a intensidade de alguns spots nos mapas protÃicos de amostras obtidas Ãs 48 sem. de idade e parÃmetros espermÃticos. Portanto, a secreÃÃo de proteÃnas no plasma seminal em cordeiros Santa InÃs ocorre de forma sincronizada com uma sÃrie de alteraÃÃes complexas no desenvolvimento sexual como um todo. Estas mudanÃas foram mais marcantes na fase de prÃ-puberdade, justamente quando os espermatozÃides comeÃaram a adquirir motilidade progressiva. O objetivo do estudo 2 foi avaliar a distribuiÃÃo topogrÃfica e a intensidade de ligaÃÃo das proteÃnas BSP A1/A2, BSP-30kDa e OPN Ã membrana de espermatozÃides ejaculados e apÃs exposiÃÃo destas cÃlulas in vitro Ãs secreÃÃes do oviduto. O padrÃo de ligaÃÃo das proteÃnas BSP-A1/A2, BSP-30kDa e osteopontina foi avaliado em espermatozÃides obtidos de sÃmen fresco e exposto seqÃencialmente aos fluidos do istmo (IODF) e da ampola (AODF) do oviduto. Foram utilizadas amostras de sÃmen de cinco touros HolandÃs, submetidos Ãs seguintes condiÃÃes: 1. EspermatozÃides ejaculados; 2. EspermatozÃides ejaculados incubados com IODF; 3. EspermatozÃides ejaculados + IODF incubados com AODF. De cada um desses tratamentos foram colhidas alÃquotas de cÃlulas espermÃticas para o procedimento de imunocitoquÃmica e anÃlise por microscopia confocal. Uma reaÃÃo positiva para BSP-A1/A2 foi detectada na peÃa intermediÃria, regiÃes equatorial e pÃs-equatorial e acrossomo dos espermatozÃides, em todos os tratamentos. A anÃlise dos diferentes planos de vÃrias cÃlulas mostrou fluorescÃncia significativamente mais intensa na peÃa intermediÃria, em comparaÃÃo com o restante das cÃlulas, independente das condiÃÃes de incubaÃÃo. O modelo de ligaÃÃo da BSP-30kDa aos espermatozÃides foi semelhante Ãquele observado para a BSP-A1/A2. AlÃm disso, nos espermatozÃides com acrossomo reagido, a fluorescÃncia apresentou reduÃÃo de 4,9 e 3,6 vezes apÃs exposiÃÃo aos fluidos do istmo e da ampola, respectivamente. A ligaÃÃo da osteopontina foi identificada na regiÃo pÃs-equatorial e na extremidade do acrossomo em espermatozÃides ejaculados, apresentando fluorescÃncia mais intensa no acrossomo em comparaÃÃo com o segmento pÃs-equatorial. A maior percentagem de cÃlulas capacitadas e capazes de reaÃÃo acrossÃmica em resposta ao LPC ocorreu apÃs exposiÃÃo das cÃlulas aos fluidos do istmo (39,8% e 79%) e ampola (20,5% e 69,3%, respectivamente) em comparaÃÃo aos espermatozÃides expostos apenas ao MTMS (12,3% e 49,3%) e Ã heparina (23,7% e 38,9%). Conclui-se que a exposiÃÃo dos espermatozÃides aos fluidos do oviduto modifica as interaÃÃes entre as BSPs, a osteopontina e a membrana espermÃtica, sendo potencialmente um mecanismo modulatÃrio da funÃÃo espermÃtica. No estudo 3, o objetivo foi utilizar uma abordagem proteÃmica para identificar detalhadamente as proteÃnas presentes no fluido epididimal de touros sexualmente maduros. Foram obtidas amostras de fluido da cauda do epidÃdimo (CEF) de 11 touros HolandÃs maduros, canulados nos ductos deferentes. As amostras foram utilizadas para a preparaÃÃo de mapas protÃicos, atravÃs de eletroforese 2D, os quais foram analisados pelo software PDQuest, sendo os spots identificados por espectrometria de massa. Esta primeira anÃlise do CEF mostrou que cerca de 21% da intensidade de todos os spots dos gÃis era composta por albumina, prejudicando a identificaÃÃo de proteÃnas menos abundantes. Para contornar esse obstÃculo, a albumina foi parcialmente removida das amostras utilizando-se cromatografia de afinidade e foram preparados novos mapas bidimensionais, novamente sujeitos Ã anÃlise computadorizada. Os spots detectados nesses novos gÃis, nÃo identificados nos mapas anteriores foram tambÃm sujeitos a espectrometria de massa. Foram detectados 114 Â 3 spots, nas amostras antes da depleÃÃo de albumina, dos quais foram identificados 55, representando 23 proteÃnas. Com base na densidade Ãptica integrada dos spots, as proteÃnas mais abundantes no CEF foram albumina (21,1%), proteÃnas ligadoras de colesterol (6 isoformas de baixa massa molecular; 10,5%), prostaglandina D sintetase (PGDS; 7,6%), e gelsolina (6%), totalizando quase a metade (45,2%) do total de proteÃnas. Outros 36 spots tambÃm foram identificados, correspondendo a 13 diferentes proteÃnas. ApÃs a depleÃÃo da albumina, o nÃmero de spots detectados nos mapas passou para 137 Â 4 spots. ComparaÃÃo dos gÃis antes e apÃs o procedimento de depleÃÃo, mostrou que a intensidade da albumina foi reduzida para 1/10 da intensidade nos gÃis nÃo submetidos Ã depleÃÃo. AlÃm do aumento no nÃmero de spots, 48 deles tiveram sua intensidade aumentada em 3X, pelo menos, nos gÃis depletados em comparaÃÃo aos originais. A identidade dessas proteÃnas sugere que elas apresentam uma enorme gama de funÃÃes, incluindo a modulaÃÃo do metabolismo espermÃtico, participaÃÃo na modificaÃÃo superficial da membrana e proteÃÃo dos espermatozÃides durante seu armazenamento na cauda epididimal