CaracterizaÃÃo, anÃlise filogenÃtica e perfil de expressÃo da famÃlia multigÃnica do fator de elongaÃÃo 1 alfa (EF1α) de soja [Glycine max (L.) MERR.]: detecÃÃo de genes normalizadores para qPCR - Katia Daniella da Cruz Saraiva (2013)
O fator de elongaÃÃo 1alfa (EF1α) Ã responsÃvel pela ligaÃÃo do aminoacil-tRNA ao sÃtio A do ribossomo, atuando, assim, na fase de alongamento da sÃntese proteica. O EF1α em plantas Ã codificado por uma famÃlia multigÃnica com nÃmero de genes variÃvel entre espÃcies. O objetivo do presente trabalho foi caracterizar, analisar filogeneticamente e elucidar o perfil de expressÃo dos genes EF1α em soja durante o desenvolvimento, bem como selecionar o(s) gene(s) de referÃncia mais estÃveis para ensaios de qRT-PCR no desenvolvimento e condiÃÃes de estresse. AnÃlises in silico nos genomas de soja e de outras leguminosas disponÃveis em bancos de dados revelaram famÃlias gÃnicas de 3 a 6 membros com estrutura conservada de 2 Ãxons e 2 Ãntrons. Dentre as espÃcies analisadas (Glycine max, Cajanus cajan, Vigna unguiculata, Medicago truncatula e Phaseolus vulgaris) G. max foi a que apresentou o maior nÃmero de genes, classificados como EF1α 1a; 1b; 1c; 2a; 2b e 3 apÃs anÃlise filogenÃtica. A expressÃo dos genes EF1α foi estudada em diferentes tecidos (flores, vagens, sementes, cotilÃdones, folhas unifolioladas e trifolioladas, raÃzes, hipocÃtilos e epicÃtilos) durante o desenvolvimento da soja. A anÃlise de expressÃo por qPCR revelou que os genes EF1α sÃo funcionais, sendo expressos em todos os tecidos, contudo apresentam expressÃo diferencial dependente do tecido e do estÃdio de desenvolvimento. A expressÃo relativa entre os genes membros mostrou predomÃnio de expressÃo para 5 dos 6 genes analisados: EF1α 1a: sem predomÃnio de expressÃo; EF1α 1b: GerminaÃÃo e desenvolvimento do hipocÃtilo; EF1α 1c: Desenvolvimento da vagem; EF1α 2a: Desenvolvimento da vagem, folhas unifoliolada e trifoliolada; EF1α 2b: Desenvolvimento da vagem, folhas unifolioladas; EF1α 3: GerminaÃÃo, flores, raÃzes, fases iniciais do desenvolvimento do hipocÃtilo e epicÃtilo. Esses dados, juntamente com os de folhas e de raÃzes submetidas a condiÃÃes de estresse (PEG e AS) foram usados para avaliar a estabilidade de expressÃo dos diferentes genes EF1α de soja atravÃs dos programas GeNorm e NormFinder. Para as anÃlises durante o desenvolvimento, quatro genes de expressÃo estÃvel (UKN1, SKIP16, EF1β e MTP) foram tambÃm utilizados. Os genes EF1α foram mais estÃveis em cotilÃdones (EF1α 3 e EF1α 1c); epicÃtilos (EF1α 1b, EF1α 2b e EF1α 1a); hipocÃtilos (EF1α 1a e EF1β); vagens (EF1α 2a e EF1α 2b) e raÃzes (EF1α 2a e UKN1) e menos estÃveis em folhas trifolioladas/unifolioladas (UKN1 e SKIP16) e sementes em germinaÃÃo (EF1β e SKIP16). Em folhas sob condiÃÃes de estresse, anÃlises atravÃs do GeNorm revelaram que quatro genes (EF1α 2a >1b >2b >1a) apresentaram classificaÃÃo de estabilidade semelhante nos estresses por AS e PEG. JÃ em raÃzes, distinto padrÃo de estabilidade foi encontrado: EF1α 2a > 1c >2b >1b > 1a >3 para PEG e EF1α 1c > 3 > 2a > 1a > 2b > 1b para AS. Tais resultados foram confirmados usando o programa NormFinder. A despeito das variaÃÃes de expressÃo gÃnica em diferentes tecidos em desenvolvimento e condiÃÃes de estresse, foram determinados genes EF1α que podem ser usados para normalizar ensaios de PCR em tempo real em soja e leguminosas (tribo Phaseoleae) vez que genes EF1α ortÃlogos foram identificados entre essas diferentes espÃcies.