Clonagem e expressão de irisina canina em Escherichia coli - Cavalcante, Thatiana Farias (2023)
Introdução: A irisina é uma proteína produzida de modo endógeno quando há estímulo físico contínuo. É produto da clivagem da proteína transmembrana fibronectina tipo III contendo o domínio 5 (FNDC5). Além do peptídeo sinal e da porção C-terminal, a FNDC5 tem uma região transmembranar e o domínio irisina. O exercício físico tem ação direta na síntese proteica, uma vez que, ativa a expressão do gene PGC1-α que induz a síntese da proteína FNDC5 com consequente liberação da irisina. No tecido adiposo age positivamente sobre a molécula UCP1, levando ao aumento da densidade mitocondrial, alto consumo de oxigênio e mudança das características fenotípicas dos adipócitos brancos para bege. Essas características estão associadas ao emagrecimento, melhora da resistência à insulina e regressão da síndrome metabólica. No sistema nervoso central promove a sobrevivência, manutenção e função das células neurais. Em cães, assim como em humanos, a obesidade é um fator de risco para o desenvolvimento de disfunções metabólicas como, por exemplo, diabetes mellitus, perfis lipídicos alterados e hipertensão. A disfunção cognitiva canina afeta cerca de 60 % dos cães mais idosos, e está relacionada com o depósito de moléculas beta-amilóide. Visando futuro desenvolvimento um medicamento para tratamento dessas disfunções caninas, esse projeto tem como objetivo a clonagem e expressão da sequência codificadora de irisina canina em Escherichia coli. Material e Métodos: A sequência gênica da proteína foi selecionada a partir do banco de dados UniProt. O alinhamento da sequência a fim de analisar a similaridade entre humanos e cães foi feito utilizando o programa Blast-p. Uma vez selecionada a sequência, o gene foi desenhando e encomendo para síntese química com códons preferenciais de E.coli e clonado no vetor pUC-18. A sequência de irisina portadora de sítios das enzimas de restrição Ndel e BamHI nas extremidades foi subclonada nos sítios das mesmas enzimas no vetor de expressão pDMU01, resultando no plasmídeo recombinante pTI01. Para transformação e expressão do gene o pTl01 foi introduzido por eletroporação na linhagem de E. coli DH5αF´Iq. Uma colônia recombinante foi inoculada em 50 mL de meio Luria Bertani contendo ampicilina 100 ug/mL o e cultivada a 37 oC, rotação de 150 rpm por 32 h. Quando a cultura atingiu 0,5 OD600/mL a expressão foi induzida adicionando-se IPTG para a concentração final de 1 mM. Durante o crescimento foram coletadas alíquotas em espaços de tempo específicos para medida da absorbância e análise da proteína recombinante por eletroforese SDS-PAGE. Resultados e discussão: A digestão do vetor pUC18-IRISINA contendo o gene de expressão, assim como do vetor de expressão pDMU01 com as enzimas de restrição Ndel e BamHI foi eficientemente realizada. A ligação do gene ao plasmídeo pDMU01 foi confirmada por digestão enzimática utilizando as respectivas enzimas, tendo sido possível observar em gel de agarose a liberação de um fragmento de 432pb do PTI01 referente a região codificadora da irisina. A expressão gênica foi confirmada através de gel SDS-PAGE onde observou-se uma banda de aproximadamente 17kDa correspondente à massa molecular da irisina canina.