Clonagem e caracterização enzimática de uma lipase isolada de uma biblioteca metagenômica de terra preta de índio - Carmo, Edson Júnior (2017)
O avanço das tecnologias moleculares no campo científico, possibilitou o desenvolvimento de diversas formas de acesso ao material genético dos organismos, de forma a ser possível localizar, mapear, isolar, caracterizar e decodificar os genes alvo de um indivíduo particular ou de um conjunto de indivíduos coexistentes em um ambiente específico. Estudos metagenômicos são bastante promissores em diversas áreas da biotecnologia, como nas descobertas de novas moléculas de interesse biotecnológico industrial, na investigação de novos antibióticos e fármacos, na biorremediação de ambientes impactados com metais tóxicos e na prospecção de enzimas diversas. O objetivo deste trabalho foi caracterizar enzimaticamente uma enzima lipase previamente rastreada de uma Biblioteca Metagenômica de Terra Preta de Índio. A sequência correspondente ao gene de lipase foi isolada da biblioteca metagenômica, clonada e expressada em Pichia pastoris sob controle do promotor PGK. A lipase recombinante foi caracterizada pela atividade de hidrólise de substratos lipídicos e capacidade de síntese em solvente orgânico. Análises in silico da sequência proteica inferem a identificação de uma lipase extracelular pertencente à / - hidrolase e com função molecular para atividade lipásica. A enzima foi produzida eficientemente em P. pastoris e a lipase recombinante apresentou atividade de 374,59 U/mL hidrolisando p-nitrofenil palmitato, Vmax(ap.) 143,4 U/mL.min-1, Km(ap.) 1,4 mM e Kcat(ap.) 103,7 S-1. A enzima possuiu atividade máxima em pH 8,0, temperatura 90 ºC e se manteve estável em altas temperaturas. A capacidade de síntese foi avaliada pela formação de laurato de etila pela reação de esterificação do ácido láurico com etanol apresentando rendimento de 70% em 45 minutos de reação. A proteína recombinante se caracteriza como uma enzima alcalina, termotolerante, ativada por cálcio, EDTA e detergentes.