Metabolic characterization of grapevine leaves: first clues towards biomarkers discovery
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| Data de Publicação: | 2016 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/24679 |
Resumo: | Tese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016 |
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Metabolic characterization of grapevine leaves: first clues towards biomarkers discoveryVitis viniferaPlasmopora viticolaDowny midewMetabolómicaFT-ICR-MSqPCRExpressão de genesTeses de mestrado - 2016Departamento de Química e BioquímicaTese de mestrado, Bioquímica (Bioquímica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2016A videira (Vitis vinifera L.) é atualmente a árvore de fruto mais cultivada em todo o mundo devido à sua importância económica na indústria vinícola. Em 2014, a área mundial coberta por vinhas para produção de uvas, passas de uva, vinho e outros produtos foi de 7375 kha (Relatório anual da Organização internacional de vinha e vinho). A União Europeia é líder mundial na produção de vinho, tendo quase metade da área vinícola total (Relatório Anual e Estatísticas da produção vinícola - Rede Global de Informação Agrícola, 2014). Em relação à produção de vinho, França, Itália, Espanha e Argentina são atualmente os cinco países com maior produção. Por outro lado, a China, Turquia, Irão e Índia são os maiores produtores mundiais de uvas frescas para consumo. Portugal é o décimo produtor de vinho a nível mundial e o quinto na Europa, tendo este sector uma elevada importância estratégica para a economia do País, representando cerca de 890 milhões € em exportações só em 2013 (dados de Global Agricultural Information Network, 2013). De todos os produtos vitícolas, e apesar das uvas e do vinho serem maioritariamente os mais comercializados, alguns países como a Turquia, Arábia Saudita, Grécia, Bulgária, Roménia e Vietnam estão a cultivar algumas espécies de videira especificamente para a produção de folhas para consumo na alimentação. Em Portugal, as folhas de algumas cultivares de videira começaram já a ser analisadas para a inclusão na dieta, devido ao seu conteúdo antioxidante e compostos fenólicos. Os seus benefícios para a saúde têm sido cada vez mais estudados, tendo-se demonstrado que este produto pode ser utilizado, por exemplo, para o tratamento de dores crónicas, processos inflamatórios e pressão arterial elevada. Estas propriedades, o valor nutricional, o sabor e a qualidade são devidos a uma diversidade de compostos secundários como compostos fenólicos, ácidos orgânicos, lípidos e glúcidos. As cultivares de Vitis vinifera normalmente utilizadas na produção de vinho são suscetíveis ao míldio, uma doença extremamente destrutiva causada pelo fungo Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni. Esta doença foi acidentalmente introduzida na Europa durante o século XIX e continua a ser uma das mais destrutivas doenças que afetam as vinhas neste continente. Estudos realizados indicam que, em interações compatíveis, este fungo poderá controlar o metabolismo das células hospedeiras, permitindo assim a sua sobrevivência e proliferação, promovendo a destruição completa das vinhas e consequentemente significantes perdas económicas. Em 2014, a colheita de uva em Portugal diminuiu cerca de 5.7%, devido a más condições meteorológicas na região Norte e devido ao aparecimento de míldio nas regiões do Centro e Sul, que subsistiu apesar dos tratamentos com fungicidas aplicados. Algumas estratégias têm sido implementadas de forma a evitar a ameaça causada pelo P. viticola, incluindo o uso intensivo de fungicidas e fitoquímicos. Estas abordagens não são eficazes, nem compatíveis com um desenvolvimento sustentável, nem seguras para a saúde pública. Para além disto, as folhas podem ser incluídas na alimentação e a sua exposição a estes produtos químicos torna a sua descontaminação e certificação para a comercialização ainda mais difícil. Algumas espécies Americanas e Asiáticas de Vitis são resistentes ao míldio, pelo que uma possível alternativa na prevenção da infeção pelo míldio é a criação de alguns híbridos intra-específicos. Esta última abordagem é claramente mais eficaz e sustentável, particularmente se for acoplada à seleção de características com interesse económico de cultivares de videira locais, permitindo a preservação das propriedades desejadas e únicas do vinho local. No entanto, um programa bem-sucedido de reprodução de plantas melhoradas com características de resistência ao míldio requer, não só uma compreensão dos mecanismos de resistência inata de cultivares contra os fungos, mas também a identificação de biomarcadores de resistência. De entre estes, os biomarcadores metabólicos podem revelar-se particularmente úteis. Inúmeros trabalhos científicos nas áreas de transcritómica, proteómica e metabolómica foram publicados na última década com abordagens para a caracterização de resistência ao míldio. Uma análise metabólica dos diversos produtos da videira é de elevada importância visto que as plantas contêm um metaboloma único que varia com as condições ambientais, o desenvolvimento da planta e infeções de patogénicas. Em relação às folhas de videira, visto que é o primeiro órgão que o P. vitícola infecta, estas podem possuir na sua composição biomarcadores de resistência ou suscetibilidade contra este patogénio. Normalmente, um estudo metabólico é realizado recorrendo a técnicas como a Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Espectrometria de Massa (MS) ou à combinação destas técnicas a processos de separação cromatográficos como a Cromatografia Gasosa (CG) ou Líquida (LC). Contudo, os limites de deteção por RMN são baixos e apesar da combinação de MS com CG e LC possibilitar a deteção de um elevado número de compostos, os processos cromatográficos demoram muito tempo e normalmente necessitam de vários passos de limpeza do equipamento. Uma solução será a utilização de Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance acoplado a um espectrómetro de massa (FT-ICR-MS) visto que é um equipamento que não só combina a elevada resolução com a elevada exatidão de massa como também permite uma rápida e fácil aquisição de resultados. Esta dissertação teve como foco principal a caracterização metabólica de folhas de Vitis vinifera cultivar Pinor noir. O primeiro objetivo foi estabelecer um protocolo de extração de metabolitos compatível com uma análise de espectrometria de massa com elevada resolução (Capítulo II). Para isso, foi desenvolvido um protocolo de extração de metabolitos com uma mistura de solventes dando origem a quatro frações (metanólica, aquosa, orgânica e acetonitrilo) que foram analisadas por FT-ICR-MS. A análise destas quatro frações foi efectuada em modo positivo e negativo, permitindo identificar no total, respetivamente, 634 e 133 massas únicas. Após o estabelecimento de um protocolo de extração otimizado, o segundo objetivo foi a análise do metaboloma das folhas de videira da cultivar Pinot noir e a importância destes compostos na saúde humana (Capítulo III). Os compostos identificados foram anotados e divididos em oito classes metabólicas principais (lípidos, glúcidos, ácidos nucleicos, compostos fitoquímicos, compostos heterocíclicos, ácidos orgânicos e derivados, benzenóides e outros) e estas posteriormente em classes secundárias e terciárias quando necessário. Do metaboloma anotado, a classe mais representada neste estudo foi a classe dos lípidos com 67%, seguida dos compostos fenólicos (13%), ácidos orgânicos (7%) e glúcidos (3%). É importante salientar que na classe dos compostos fenólicos, foi detetada pela primeira vez em folhas da cultivar Pinot noir uma antocianina acetilada. Para além disso, foi ainda realizada uma análise das vias metabólicas utilizando uma ferramenta online pública, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), de modo a perceber a cobertura dos nossos resultados e identificar compostos importantes. Finalmente, o terceiro objetivo foi comparar a nível metabólico dez espécies e cultivares, resistentes e suscetíveis ao míldio, identificar compostos presentes apenas num grupo de videiras resistentes ou suscetíveis, permitindo desta forma diferenciar os dois grupos e integrar essa informação metabólica com a quantificação de transcritos, de forma a definir marcadores de resistência (Capítulo IV). No total foram identificados nove compostos presentes apenas no grupo de videiras resistentes ou suscetíveis ao míldio. Foram também incluídos na análise sete compostos descritos na literatura como possíveis marcadores de resistência ou com padrões de acumulação em diferentes videiras. A quantificação da expressão de genes que codificam para enzimas de síntese ou degradação para estes compostos foram analisados por reação de polimerase de cadeia em tempo real (qPCR). Para este trabalho a nossa referência e o principal modelo de estudo foi a cultivar Pinot noir, sendo a expressão dos genes desta cultivar considerada como controlo para todos os outros. Para além disto, como a expressão de genes de interesse tem de ser normalizada com genes de referência, a estabilidade de onze genes foi avaliada e os três genes mais estáveis foram considerados utilizados para normalizar os dados. Cada capítulo desta tese foi escrito como um artigo científico e cada possui o seu próprio resumo, introdução, materiais e métodos, resultados e discussão, conclusão, agradecimentos e referências bibliográficas. Esta abordagem de biologia de sistemas é um ponto de partida para elucidar quais as bases moleculares inerentes à resistência e suscetibilidade das videiras e, quem sabe, a longo prazo, utilizar estes metabolitos associados à resistência no desenvolvimento de ensaios de biomarcadores para utilização em futuros programas de melhoramento e análise de linhagens.Grapevine (Vitis vinifera L.) is the most important fruit crop in the world due to its numerous food products, namely fresh and dried table grapes, wine grapes, leaves and intermediate products. Traditional premium cultivars of wine and table grapes are highly susceptible to various diseases, particularly to downy mildew. Grapevine downy mildew is caused by the biotrophic oomycete Plasmopara viticola (Berk. et Curt.) Berl. et de Toni and is one of the most destructive diseases in Vitis vinifera. In Europe, disease management became one of the main tasks for viticulture, being the current strategy, for downy mildew disease control, the massive use of fungicides and pesticides in each growing season. This practice has several associated problems, from the environmental impact to the economical level, and even in human health. The alternative approach is the introduction of resistant grapevine varieties, clearly most effective and sustainable, particularly if coupled to the selection of desirable traits from local grapevine cultivars. However, a successful breeding program of grape plants with increased resistance traits against downy mildew requires, not only an understanding of the innate resistance mechanisms of cultivars against fungi, but also the identification of biomarkers of resistance (or susceptibility). Among these, metabolic biomarkers may prove particularly useful, not only because they can be determined in a high throughput way but, above all, because metabolites provide accurate metabolic state definition. The first part of this thesis (Chapter II) focuses on the establishment of an appropriate metabolite extraction protocol for Vitis vinifera cultivar Pinot noir grapevine leaves, compatible with high resolution mass spectrometry. Different extraction protocols with different solvent mixtures were tested and the metabolic analysis was performed using direct infusion Fourier-transform ion cyclotron-resonance mass spectrometry (DI-FTICR-MS). A mixture of methanol/water/chloroform was the best extraction mixture, allowing a higher metabolite extraction yield, reproducibility and metabolome cover. Four fractions were obtained (methanol, water, organic and acetonitrile), which were analysed by FT-ICR-MS, using electrospray ionization (ESI) in both ionization modes (positive [ESI+] and negative [ESI-]). In total we identified 634 and 144 unique masses by, respectively, ESI+ and ESI-. The metabolic coverage of the fractions was compared for ESI+ and ESI- and only 59 masses were common in both ionization modes. This extraction protocol allowed the extraction of polar and non-polar compounds, covering all major classes found in plants and increasing metabolome coverage. After the establishment of an optimized and efficient extraction protocol, metabolite annotation of grapevine leaves from cultivar Pinot noir was performed, not only with the purpose of obtaining the most comprehensive metabolite analysis in Vitis vinifera, but also for metabolite characterization associated with leaves’ high nutritional value, taste and health benefits (Chapter III). Indeed, grapevine leaves are considered a healthy food due to their human health benefits, mainly for their content in a wide range of phenolic compounds. The metabolome of Vitis vinifera cultivar Pinot noir grapevine leaves was annotated and the identified compounds were classified into eight major metabolic classes (lipids, carbohydrates and conjugates, nucleic acids, phytochemical compounds, heterocyclic compounds, organic acids and derivatives, benzenoids and others), secondary and if needed into third metabolic classes. Lipids were the most represented class with 67% of the metabolome identified followed by phytochemical compounds (13%), organic acids (7%) and carbohydrates (3%). Each of these classes was further associated to human health benefits, highlighting the benefits of grapevine leaves consumption. Noteworthy, thirteen mostly used pesticides were also found in grapevine leaves, being therefore essential the development of new methodologies for quality assessment and safe commercialisation. The comprehensive metabolite analysis from Vitis vinifera leaves was the starting point for the identification of biomarkers of resistance or susceptibility against the downy mildew. In order to identify compounds present only in susceptible or in resistant grapevines, ten Vitis vinifera species and cultivars, were compared at the metabolite level (Chapter IV). The metabolite extraction protocol previously optimized was used, but only the methanol fraction (which contained some of the most relevant compounds involved in defence mechanisms) was analysed by DI-FTICR-MS using ESI+ and ESI-. A first analysis revealed nine masses distinctly identified (6 in ESI- and 3 in ESI+) that might be resistant- or susceptible-specific. The goal was to integrate this information with transcript quantification. Hence, two of these compounds were selected, together with seven other reported in literature as involved in defence mechanisms and their metabolic pathways were identified. The expression profile of several biosynthesis and/or degradation enzymes coding genes was performed by Real-time Polymerase Chain Reaction (qPCR). To have success in this analysis, qPCR studies require as internal controls one or more reference genes, for all the samples analysed. Hence, eleven possible reference genes were tested and normalization of the qPCR results from the enzyme coding genes was made using the three most stable reference genes. This systems biology approach, based on the integration of the metabolic profiling and transcriptomics will enlighten the molecular basis of the differences between susceptible and resistant cultivars. Each chapter was written as a scientific article and has its own abstract, introduction, materials and methods, results and discussion, conclusion, acknowledgements and references. This thesis is a starting point for, in the long run, use these resistance-associated metabolites in the development of streamlined biomarker assays to assist future breeding programs and introgression line analysis.Silva, Marta SousaFigueiredo, Andreia Cristina Silva Viegas Mata, 1980-Repositório da Universidade de LisboaMaia, Marisa Raquel Gomes2017-07-20T00:30:10Z201620162016-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/24679TID:201330172enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T13:31:28Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/24679Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T02:47:08.228820Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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