Filogenia, filogeografia e comportamento dos pequenos ciprinídeos do género Chomdrostoma Agassiz, 1832 (Cyprinidade, Actinopterygii) - Robalo, Joana Isabel (2007)
Os peixes anteriormente incluídos no género Chondrostoma (Cyprinidae: Leuciscinae) distribuem-se pelo Sul e Centro da Europa, desde o Oceano Atlântico até ao Mar Cáspio e desde o Mediterrâneo até ao Báltico. Estes peixes encontram-se ainda presentes na Ásia Menor, Cáucaso e Mesopotâmia. O número de espécies incluídas neste grupo tem variado de acordo com os autores, devido ao uso de diferentes critérios de diagnose (i.e. morfológicos e osteológicos ou moleculares). Os estudos anteriores sobre a filogenia molecular deste grupo tinham originado politomias não resolvidas, embora alguns ciados monofíléticos e estatisticamente robustos tenham sido identificados: toxostoma, lemmingii, polylepis, arcasii, nasus, soetta e genei. A presente tese propôs-se atingir um conjunto de objectivos numa multiplicidade de escalas. Numa escala macroevolutiva, propõs-se resolver com mais taxa e fragmentos de um número maior de genes a filogenia dos peixes tradicionalmente incluídos no género Chondrostoma. Ao mesmo tempo, procurou-se contribuir para a compreensão da diversificação deste grupo na Península Ibérica. Entre os principais resultados destacam-se os seguintes. Elaborou-se uma filogenia estatisticamente robusta dos peixes que constituíam o género Chondrostoma, que mostrou que as politomias anteriormente obtidas resultavam de amostragem insuficiente quanto ao número de taxa e/ou quantidade de fragmentos de ADN. O mapeamento dos caracteres morfológicos na filogenia obtida mostrou que caracteres anteriormente considerados como diagnósticos do género eram homoplásicos, pelo que se impôs uma revisão do género Chondrostoma. Desta revisão resultou a restrição do género Chondrostoma às espécies do grupo nasus e a criação dos novos géneros: Pseudochondrostoma, Parachondrostoma, Ibero chondrostoma, Áchondrostoma e Protochondrostoma (que correspondem respectivamente às linhagens polylepis, toxostoma, lemmingii, arcasii e genei). Os eventos ciado genéticos que deram origem à formação destas linhagens parecem ter tido lugar há cerca de 11 milhões de anos, excluindo portanto a hipótese da difusão e VII Resumo diversificação do grupo ter ocorrido durante a fase oligohalina do Mediterrâneo (Lago Maré) no fim do Messiniano. Fica assim excluída a aplicação para estes peixes do modelo de dispersão proposto por Bianco. Três dos seis géneros definidos neste trabalho são endémicos da Península Ibérica e um quarto género tem a maioria das espécies na península com uma pequena extensão em França. Estes dados e as cronologias estimadas para a diversificação dentro destes géneros sugerem que grande parte da radiação do grupo se deu na Península Ibérica muito antes do final do Miocénico parecendo, no que se refere a este grupo, que os contactos entre a península e o resto da Europa em períodos mais recentes foram muito reduzidos, limitando-se a trocas entre o nordeste de Espanha e a França. Na península os géneros Achondrostoma, Iberochondrostoma e Parachondrostoma têm distribuições disjuntas, mas adjacentes, que sugerem que processos de vicariância podem ter tido um papel fundamental na sua diferenciação. Pseudochondrostoma apresenta grande número de semelhanças (e.g. boca ínfera e dotada de estojo córneo, tamanho comparativamente grande, migrações pré-reprodutoras) com os géneros Parachondrostoma e Chondrostoma. Discute-se a possibilidade destas semelhanças resultarem de convergência ou de episódios de hibridação antigos. A análise fiíogenética do género Achondrostoma permitiu mostrar que este género inclui duas linhagens separadas já desde o Miocénico. A. arcasii revelou-se polifilético incluindo peixes das duas linhagens acima referidas, sendo urgente uma revisão da sua taxonomia. Esta informação fiíogenética combinada com dados morfológicos permitiu identificar uma nova espécie no sudoeste da área de distribuição do género Achondrostoma, endémica do distrito de Lisboa e considerada Criticamente Em Perigo {Achondrostoma occidentale). Por o nome se encontrar indisponível foi necessário renomear Achondrostoma macrolepidotum, para A. oligolepis. A análise da filogeografia profunda do género Iberochondrostoma levou à proposta de um modelo de especiação em que uma grande espécie central, Iberochondrostoma lemmingii, originou na sua periferia e em diferentes períodos geológicos, diversas espécies de distribuição mais restrita. Este modelo de especiação do tipo peripátrico, suportado por dados de ADN nuclear e mitocondrial, parece consistente com a história geológica da Península Ibérica no Terciário. Procedeu-se à análise filogeográfica das populações de uma das espécies deste género, /. lusitanicum, tendo-se identificado ESUs distintas que impõem a descrição, o mais breve VIII possível, de uma nova espécie e fornecem informações importantes para o delineamento de estratégias de conservação desta espécie Criticamente Em Perigo. O estudo do comportamento reprodutor de /. lusitanicum bem como o estudo do comportamento agonístico de Pseudochondrostoma polylepis forneceram elementos etológicos relevantes para a conservação destes ciprinídeos. Do mesmo modo, o estudo da expansão de Alburnus alburnus na Península ibérica, que se tem acelerado de forma muito acentuada nos últimos anos, traz igualmente informações importantes para o delineamento de estratégias de conservação dos ciprinídeos nativos, cujas potenciais interacções ecológicas com esta exótica se encontram totalmente inexploradas. O desenvolvimento deprimers que permitem amplificar eficazmente um fragmento de mais de 900 bases do gene nuclear da beta-actina foi fundamental em quase todos os estudos genéticos referidos acima. Para além de contribuir para os estudos filogenéticos e filo geográficos já referidos, permitiu esclarecer a natureza do ancestral paterno de Squalius albumoides uma espécie hibridogenética que resultou de cruzamentos entre fêmeas de Squalius pyrenaicus e machos filogeneticamente muito próximos, mas distintos, de Anaecypris hispânica. O facto de peixes dos géneros Alburnus e Squalius híbridarem facilmente e a proximidade filogenética entre Alburnus,, Anaecypris e uma das linhagens que integra S. albumoides leva a considerar com grande preocupação a expansão de Alburnus alburnus cujo grande potencial de hibridação com peixes do género Squalius é conhecido e que pode bibridar e descaracterizar várias espécies endémicas da península. Finalmente desenvolveu-se e validou-se um novo método que permite atribuir as diferentes bases presentes nos cromatogramas de ADN diplóide ou polipióide a cada uma das cadeias constitutivas tirando partido de artefactos da sequenciação induzidos na vizinhança de indels em heterozigotia. Este método é útil tanto na análise de múltiplos SNP's no mesmo fragmento, como na identificação das sequências de ADN presentes em híbridos e na distinção de vários típos de políplóides. ------ABSTRACT ------ Fishes formeríy included in the genus Chondrostoma (Cyprínidae: Leuciscinae) are distributed through South and Central Europe, from the Atlantic to the Caspian and from the Mediterranean to the Baltic. They are also found in Ásia Minor, the Caucasus and Mesopotamia. The number of species included in the group has varied according with the authors due to the use of different diagnostic críteria (í.e, morphological and osteological or molecular). Previous molecular phylogenetic studies of this group yielded unresolved polytomies although some monophyletic and statistically well supported clades were identifíed: toxostoma, lemmingii, polylepis, arcasii, nasus, soetta e genei, The present thesis aimed to achieve several objectives at various leveis. At a macroevolutionary scale this study attempted to solve the phyiogeny of the fish traditionally included ín Chondrostoma with a broader sample of taxa and more DNA fragments. At the same time the study aimed to clarify the diversification of this group in the Iberian Península. The main results can be summarized as follows. A statistically robust phyiogeny of the fish formeríy included in the genus Chondrostoma was obtained. The former polytomies were solved which indicates that they were likeiy due to insufficient taxon sampiing or scarcity of molecular data. Mapping of morphological characters on the inferred phyiogeny showed that several traits considered to be diagnostic of the genus were homoplasic. Thus a revison of the genus Chondrostoma was undertaken. This revision restricted the genus Chondrostoma to the nasus lineage and gave rise to the new genera Pseudochondrostoma, Par achondrostoma, Iberochondrostoma, Achondrostoma and Protochondrostoma (corresponding to the lineages polylepis, toxostoma, lemmingii, arcasii and genei, respectivefy). The cladogenetíc events that gave rise to these lineages seem to have occurred 11 million years ago, excluding the hypothesis of diffusion and diversification during the oligohaline Lago Maré phase of the Mediterranean, near the end of the Messinian. Thus the model of dispersai proposed by Bianco does not hold for this group of fish. XI Sitmmary Three of the six genera defmed in this work are endemic of the Iberian Península and another one has the majority of its species in the península, with a little extension to France. These data and the chronology estimated for the diversifícation inside these genera suggest that most of the radiation in this group occurred ín the Iberian Península long before the end of the Miocene. It seems that in this group the contacts between the península and the rest of Europe were, ín recent times, very scarce, and limited to connectíons between northeast Spain and France. In the Iberian Peninsula the genera Achondrostoma, Iberochondrostoma and Parachondrostoma have disjunct but adjacent distribution áreas which suggests that vicariant processes may have played a fundamenta! role in their differentiation. Pseudochondrostoma shows several resemblances with the genera Parachondrostoma and Chondrostoma (e.g. inferior mouth with a horny blade, comparably large size and pre-reproductive migrations) with the genera Parachondrostoma and Chondrostoma. The hypotheses of these resemblances being the result of convergent evolution or ancient hybridization events are discussed. The phylogenetic analysis of the genus Achondrostoma showed that this genus inciudes two lineages separated since the Miocene. A. arcasii is polyphyletic and includes físh from the two lineages referred above, thus a revision of its taxonomy is urgently needed. This phyíogenetic information, combined with morphological data, allowed the identification of a new species in the southwest of the distribution área of the genus Achondrostoma, Achondrostoma occidentale. This new species is endemic of the Lisbon district and it is considered Critically In Danger. As the name macrolepidotum was unavailable it was necessary to rename Achondrostoma macrolepidotum to A. oligolepis. The analysis of the deep phyiogeography of the genus Iberochondrostoma resulted in the proposal of a model of speciation in which a large central species, Iberochondrostoma lemmingii, originated in its períphery and at different geological times, diverse species with small distribution áreas. This peripatric speciation model is supported by mitochondrial and nuclear DNA and it seems consistent with the geological history of the Iberian Peninsula in the Tertiary. The phyíogeographic analysis of the populations of Iberochondrostoma lusitanicum aliowed the identification of distinct ESUs, which in turn impose the description of a new species, as soon as possible, as well as reveaiing importam informatíon to the conservation strategies of this Critically in Danger species. XII Summary The studies on the reproductive behaviour of / lusitanicum, and on the agonistic behaviour of Pseudochondrostoma polylepis revealed some ethologícal patterns relevant to the conservation of the species. It was also the case with the study on the expansíon of Albumus âlburnus in the Iberian Península, a species which has spread very quickly in recent years. The development of primers that allowed the amplifícation of a fragment of more than 900 base pairs of the nuclear beta actin gene was fundamental to almost ali genetic studies referred above. Beside its contribution to these studies, it allowed the recognition of the paternal ancestor of Squalius alburnoides an hybridogenetic species which resuited from crossings between S. pyrenaicus females and males phylogenetically very close to but distinct from Anaecypris hispânica. The fact that species of the genera Albumus and Squalius hybridize easily and the phylogenetic proximity between Alburnus, Anaecypris and one of the lineages that integrates S. alburnoides, brings great concerns about the expansion of Albumus âlburnus. The high potential of hybridization recorded between this last species and fishes of the genus Squalius is well known and may result in the genetic descaracterization of several species endemic to the Iberian Península. Finally, a new method was developed and validated, that allows the attribution of different bases present in the DNA chromatograms of diploid or polyploidy fishes to each one of the constitutive chains, taking advantage of artefacts of the sequencing process induced in the vicinity of heterozygous indels. This method is useful in the analysis of multiple SNP's in the same fragment, in the Identification of DNA sequences present in hybrids and in the distinction of several kinds of polyploids.