Disentangling the role of Limosilactobacillus reuteri D-lactate in lipid metabolism

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Main Author: Romero, Brian Nathan Saavedra
Publication Date: 2022
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/10451/62872
Summary: Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.
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spelling Disentangling the role of Limosilactobacillus reuteri D-lactate in lipid metabolismNAFLDMicrobiota: Limosilactobacillus reuteriD-lactatoD-ldhTeses de mestrado - 2022Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A doença de fígado gordo não alcoólico (do inglês NAFLD) compreende um amplo espectro de alterações hepáticas desde esteatose simples até carcinoma hepatocelular. Devido à globalização de uma dieta ocidentalizada, a NAFLD tornou-se a doença hepática crónica mais comum, tendo sido associada à disbiose da microbiota intestinal. Probióticos são bactérias com a capacidade de restaurar a homeostasia intestinal do hospedeiro, tendo o seu efeito benéfico já sido demonstrado no alívio da NAFLD. Recentemente mostrámos que ratinhos suplementados com Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri) apresentam menor progressão da doença hepática num modelo de lesão hepática, em parte através da produção de D-lactato. Neste projeto, dada a capacidade de L. reuteri modular a doença hepática, prevemos que o metabolito D-lactato possa regular diretamente o metabolismo hepático, melhorando a patologia da NAFLD. Após confirmação de que o Lactato é o principal metabolito produzido por L. reuteri, determinámos a eficácia do D-lactato em modular o metabolismo lipídico e a inflamação em testes in vitro com linhas celulares de hepatócitos e macrófagos. Estas foram expostas a palmitato de sódio (PA) 125 µM na presença/ausência de 1 e 5 mM de D-lactato ou L-lactato (controlo). Uma vez que D- e L-lactato podem participar na mesma via metabólica, também silenciámos a expressão do gene D-lactato desidrogenase (D-ldh) nos hepatócitos e avaliámos os níveis de mRNA de genes relacionados com transporte de ácidos gordos (Cd36 e Cpt1), biossíntese de lipídios (Lxr, Srebp1c, Chrebp, Acc1, Fasn, Dgat2 e Pparγ), fissão e fusão mitocondrial (Fis1, Drp1, Mfn2 e Opa1) e inflamação (IL-8, Tnf-α, e Tgf-β). Nos hepatócitos tratados com PA, o D-lactato reduziu significativamente os níveis de expressão de mRNA de Cd36, Cpt1, Srebp1c, Dgat2 e Pparγ, bem como os níveis das proteínas CD36, CPT1, MFN2 e DRP1. Já nos macrófagos tratados com PA, o D-lactato afetou significativamente os níveis do mRNA de Pparγ. Por fim demonstrámos fenotipicamente que o D-lactato tem um efeito protetor contra a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Assim, demonstrámos também que, o efeito protetor do D-lactato poderá estar relacionado com via de sinalização PDK4, colesterol e/ou o PPARγ. Desta forma, entender as vias metabólicas por trás da modulação do D-lactato na resposta de hepatócitos e macrófagos na acumulação de lípidos é essencial para desvendar o papel de L. reuteri na melhoria da NAFLD. Este trabalho expande o conhecimento sobre a forma como os metabolitos derivados da microbiota afetam a homeostasia metabólica do hospedeiro, destacando-se o papel do D-Lactato na regulação do metabolismo hepático, sugerindo novas abordagens terapêuticas.Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) comprises a wide spectrum of liver alterations from simple steatosis to hepatocellular carcinoma. Due to a westernized diet, NAFLD is becoming the most common chronic liver disease and its association with gut microbiota dysbiosis has been demonstrated. Currently, there is increasing interest in the use of probiotics to alleviate NAFLD outcomes. We have recently shown that mice supplemented with the probiotic Limosilactobacillus reuteri (L. reuteri) were protected from liver disease, partially via D-lactate production. Given the ability of L. reuteri to modulate gut homeostasis and dysbiosis, we hypothesized that its principal metabolite D-lactate may directly modulate liver lipid metabolism to ameliorate NAFLD. Firstly, we confirmed by GC-MS that Lactate is a major metabolite produced by L. reuteri. Subsequently, we aimed to unveil the role of D-lactate in hepatocyte and macrophage lipid metabolism and inflammation by exposing hepatocytes and macrophages to sodium palmitate (PA) 125 µM in the presence/absence of sodium D-Lactate or L-Lactate (control) 1 and 5 mM. Since both D- and L-lactate might share the same metabolic pathway, we silenced D-ldh gene expression in hepatocytes. We next assessed mRNA levels of genes related to fatty acid uptake (Cd36 and Cpt1), lipid biosynthesis (Lxr, Srebp1c, Chrebp, Acc1, Fasn, Dgat2, and Pparγ), mitochondrial fission (Fis1 and Drp1) and fusion (Mfn2 and Opa1), and inflammation (IL-8, Tnf-α, and Tgf-β). The results showed that modulation with both concentrations of D-lactate reduced significantly mRNA expression levels of Cd36, Cpt1, Srebp1c, Dgat2, and Pparγ in PA-treated hepatocytes, but only mRNA expression of Pparγ in PA-treated macrophages. Further, protein production in hepatocytes was confirmed for CD36, CPT1, MFN2, and DRP1 by Western blot. In addition, a Nile Red assay demonstrated that D-lactate but not L-lactate protected against lipid accumulation. Moreover, we showed that the protective effect of D-lactate might be linked, in part, to the PDK4 pathway, as well as to cholesterol and/or PPARγ signalling. In conclusion, understanding the metabolic pathways behind D-lactate modulation in hepatocyte and macrophage response to lipid accumulation may unveil the role of L. reuteri in NAFLD improvement. We provide new insights into how microbiota-derived metabolites affect host metabolic homeostasis, focusing on the role of D-lactate in the regulation of liver metabolism while hinting at novel therapeutics.Research Institute for Medicines (iMed.ULisboa), Faculty of Pharmacy, University of Lisbon.Santos, André Fernando Anastácio dosRodrigues, Cecília Maria PereiraRepositório da Universidade de LisboaRomero, Brian Nathan Saavedra2022-11-252022-10-282025-11-25T00:00:00Z2022-11-25T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/62872TID:203198603enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:59:00Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/62872Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:30:46.263548Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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