How the IncRNA Zeb2-NAT regulates the expression of Zeb2
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| Publication Date: | 2019 |
| Format: | Master thesis |
| Language: | eng |
| Source: | Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) |
| Download full: | http://hdl.handle.net/10451/43692 |
Summary: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019 |
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How the IncRNA Zeb2-NAT regulates the expression of Zeb2Zeb2 NATGene expression regulationNon coding RNACloningCRISPR-SAMTeses de mestrado - 2019Domínio/Área Científica::Ciências Médicas::Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2019Nowadays we can state that RNA is not only translated into protein as the central dogma of molecular biology previewed, but it can also influence the transcription and translation of other coding or non-coding RNAs. In fact, studies have shown RNAs with catalytic functions, suggesting that RNA may have been the first self-replicating molecule with enzymatic and regulatory capabilities and if true, we should expect to find RNA molecules carrying regulatory functions, acting directly or indirectly on DNA, and regulating mRNAs expression levels. Advancements in RNA sequencing technology over the last decade has enabled the discovery of all the transcribed bases in the human genome and the conclusion was that a up to 90% of the human genome is transcribed producing a variety of RNAs that do not code for proteins, collectively referred as noncoding RNA (ncRNA). The big challenge now is to identify and understand the function of these ncRNAs, their mechanisms of action, and uncover their potential regulatory mechanisms over other genes. This not only will improve our knowledge about foundations of gene regulation as it will give us the opportunity to manipulate gene expression through new ways. At present, ncRNAs, excluding the previously well characterized rRNAs, tRNAs, snRNAs and snoRNAs, are classified as small or long depending on whether they are comprised of less or more than 200 nucleotides. The long noncoding RNAs (lncRNAs) are further classified according to their genomic position and orientation relative to a protein coding gene. Intergenic long nonconding RNAs (lincRNA) are located between two protein coding genes, intronic lncRNA are entirely encoded in an intron of a protein coding gene while sense lncRNAs overlap protein coding gene exons. lncRNAs can also be bidirectional when transcription starts at less than 1kb from a protein coding gene start site and goes in the opposite direction. Some lncRNAs are transcribed from the strand opposite to the sense transcript of a protein coding or noncoding gene and are called natural antisense transcripts (NATs). NATs can be classified according to their relative position to the protein coding or noncoding gene. They can be “head-to-head”, when sense and antisense transcripts overlap on their 5’ ends; “tail-to-tail”, when sense and antisense transcripts overlap on their 3’ ends; and “full overlap”, when one transcript is totally included in the other one. NATs have been less studied than other classes of ncRNA because their detection and quantification require the preservation of information about the transcript-originating strand along with the sequencing process. Antisense transcription, which was initially considered as transcriptional noise, is increasingly being recognized as an important regulator of gene expression. It has been shown to influence almost all stages of gene expression, either through the act of transcription or through the NAT that is produced. NATs can exert their function in cis (affecting the allele from which they originated) or in trans (affecting an unlinked genomic locus). They have been implicated in development, epigenetic regulation, transcriptional interference, regulation of alternative splicing and can also be cleaved by Dicer and Drosha to form microRNAs. Epigenetic modifications encompass DNA methylations of cytosine in CpG islands and histone modifications by methylation or acetylation of lysine residues. NATs and, more widely, ncRNAs, are thought to affect DNA methylation by interacting with various types of proteins involved in histone modification or chromatin remodeling such as the polycomb repressive complex 2 (PRC2). This interaction can prevent this complex from binding the sense transcript by competition. This complex can also prevent the interaction of the sense gene with RNA Pol II or the chromatin. In addition, more recently, NATs have been described to control stemness and cell differentiation. A very recent study also revealed that antisense transcription can be a novel regulatory layer with implications in reprogramming efficiency of aged cells and conservation of pluripotent features. This study showed that a lncRNA that is overlapping and antisense to the Zeb2 locus regulates expression of the Zeb2 protein in mouse fibroblasts and ES cells. Zeb2 (zinc finger E-box binding homeobox 2) is a transcription factor, repressor of E-cadherin, that activates epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). This is of the upmost importance since the opposite mechanism, mesenchymal-to-epithelial transition (MET), is an important mechanism required during cellular reprogramming of fibroblast. This study showed that fibroblasts from old mice express higher levels of Zeb2 when compared to fibroblasts from younger mice, which is correlated with their reduced reprograming potential. In agreement with this observation they showed that reducing the levels of Zeb2-NAT RNA results in downregulation of Zeb2 protein which enhances the reprograming of old fibroblasts into iPSCs. Additionally, they found that Zeb2-NAT expression is rapidly upregulated when embryonic stem (ES) cells receive differentiation stimuli and knocking down this antisense transcript is sufficient to maintain challenged ES cells in a state of self-renewal and pluripotency. Although this study underscores the physiological role of Zeb2-NAT in fine-tuning the expression the protein-coding gene Zeb2, the mechanism by which it happens is not fully understood. The transcription start site of Zeb2-NAT is located within the large first intron of the Zeb2 and the transcript overlaps the splice site in Zeb2 pre-mRNA. One hypothesis is that as a direct consequence of this overlap, expression of Zeb2-NAT prevents excision of the first Zeb2 intron, which has an IRES that allows the correct translation of its protein. In mouse what has been shown is that compared to mouse embryonic fibroblasts, the fibroblasts from old mice have higher levels of Zeb-NAT which is correlated with higher levels Zeb2 transcripts and protein. However, the increase in transcripts that retain the first intron is paralleled by an increase in Zeb2 transcripts with spliced intron 1, raising the possibility of a concomitant age-dependent upregulation of Zeb-2 transcription. In addition, the same study also showed that Zeb2-NAT knockdown results in a significant reduction in the levels of Zeb2 mRNA and Zeb2 transcripts with intron 1 retention, suggesting that down-regulation of the antisense Zeb2-NAT results in lower levels of nascent sense Zeb2 transcripts. Based on the observation that higher levels of Zeb2-NAT are positively correlated with increased levels Zeb2 transcripts we hypothesized that Zeb2-NAT is involved in the regulation of Zeb2 transcription. The goal of this project was to test this hypothesis and dissect the mechanism used by this antisense transcript to regulate transcription of corresponding sense gene. As model system in this study I used the murine mammary carcinoma cell line 4T1 because these cells express both Zeb2 and Zeb2-NAT. I started by analyzing the effect of transfecting these cells with two 2′ OMe RNA oligonucleotides mimicking Zeb2-NAT on the expression of Zeb2. The goal was to overexpress Zeb2 NAT and determine if this affects the levels of Zeb2. However, this approach did not produce any effect on the levels of nascent Zeb2 transcripts. Because the total levels of Zeb2 NAT were not affected by the transfection of the oligonucleotide mimics and there is no way to control the efficiency of the transfections it was not possible to take any conclusions. As an alternative approach, we decided to clone Zeb2 NAT gene in a eukaryotic expression vector for transient transfection in 4T1 cells. However, despite the many attempts, the cloning was not successful. Therefore, instead of overexpress Zeb2 NAT in trans through transfection of the 2’OMe RNA oligonucleotides mimicking Zeb2 NAT or through transfection of a plasmid encoding the Zeb2 NAT gene, we decided to enhance its expression in cis through activation of its endogenous promoter. In order to accomplish this, I have used a recent technique called CRISPR/Cas9 synergistic activation mediator (SAM) or CRISPR-SAM which uses an engineered protein complex of CRISPR-Cas9 that is able to mediate efficient transcriptional activation at endogenous genomic loci through RNA-guided transcription activators. After confirming that CRISPR-SAM works in the activation of endogenous gene promoters with a notorious increase on gene expressions, we proceeded with Zeb2 NAT endogenous promoter activation assays to assess the role of this lncRNA on the regulation of the corresponding sense gene. Different guides were designed to target CRISPR-SAM to the promoter region of Zeb2 NAT, both on the template and non-template strands. Analysis of the levels of Zeb2 NAT mRNA after CRISPR-SAM with each of the guides for the non-template strand of the promoter region of Zeb2 NAT showed an increase in the mRNA levels with two of the guides. This indicates that CRISPR-SAM was able to activate transcription of Zeb2 NAT. When the levels of Zeb2 mRNA were analyzed to determine the effect of the transcriptional activation of Zeb2 NAT on the transcription of Zeb2 we could see that the Zeb2 mRNA levels were also increased with the same guides. This indicates that antisense noncoding RNA Zeb2-NAT may function as a transcriptional regulator of the corresponding sense protein coding gene Zeb2 as we hypothesized.Atualmente, podemos afirmar que o RNA não é apenas traduzido em proteína como previsto pelo dogma central da biologia molecular, como também pode influenciar a transcrição e tradução de outros RNAs codificantes ou não codificantes. De facto, estudos mostraram RNAs com funções catalíticas, sugerindo que o RNA pode ter sido a primeira molécula auto-replicante com capacidades enzimática e reguladora e, se assim for, é expectável encontrar moléculas de RNA com funções reguladoras, actuando direta ou indiretamente no DNA, e funções regulatória nos níveis de expressão de mRNAs. Os avanços na tecnologia de sequenciação de RNA na última década permitiram a descoberta de todas as bases transcritas no genoma humano, e a conclusão que até 90% do genoma humano é transcrito, produzindo uma variedade de RNAs que não codificam proteínas, coletivamente referidos como RNAs não codificantes (ncRNA). O grande desafio agora é identificar e entender a sua função, os seus mecanismos de ação e descobrir os seus potenciais mecanismos de regulação noutros genes. Assim, não só melhorará o nosso conhecimento sobre os fundamentos da regulação génica, como também nos permitirá manipular a expressão génica de novas maneiras. Atualmente, os ncRNAs, excluindo os já caracterizados rRNAs, tRNAs, snRNAs e snoRNAs, são classificados como pequenos ou longos, dependendo se são constituídos por menos ou mais de 200 nucleotídeos. Os RNAs longos não codificantes (lncRNAs) são ainda classificados de acordo com sua posição genómica e orientação em relação a um gene codificante para proteínas. Os RNAs intergénicos longos não codificantes (lincRNA) estão localizados entre dois genes codificantes de proteínas, os lncRNAs intrónicos são inteiramente codificados num intrão de um gene codificante de proteínas, enquanto que os “sense” lncRNAs sobrepõem-se a exões de genes codificantes de proteínas. Os lncRNAs também podem ser considerados bidirecionais quando a transcrição começa a menos de 1kb do local de início de um gene codificante para proteína e segue na direção oposta. Alguns lncRNAs são transcritos da cadeia oposta à transcrição do “sense” de um gene codificante ou não codificante de proteínas e são chamados de transcritos anti “sense” naturais (NATs). Os NATs podem ser classificados de acordo com sua posição relativa ao gene codificante ou não codificante de proteína. Eles podem ser "frente a frente", quando as transcrições do “sense” e anti “sense” se sobrepõem nas extremidades 5'; "Cauda a cauda", quando as transcrições do “sense” e anti “sense” se sobrepõem nas extremidades 3'; e “sobreposição total”, quando uma transcrição é totalmente incluída na outra. Os NATs encontram-se menos estudados do que qualquer outra classe de ncRNA porque a sua detecção e quantificação exigem a preservação de informações sobre a cadeia de origem do transcrito, juntamente com o processo de sequenciação. A transcrição anti “sense”, que foi inicialmente considerada como ruído transcricional, está sendo cada vez mais reconhecida como um importante regulador da expressão génica. Foi demonstrado que influencia quase todos os estados de expressão génica, seja pelo acto da transcrição ou pelo próprio NAT que é produzido. Os NATs podem actuar em cis (afetando o alelo do qual se originaram) ou em trans (afetando um locus genómico diferente da sua origem). Estão associados ao desenvolvimento, regulação epigenética, interferência transcricional, regulação de “splicing” alternativo e também podem ser cortados pelo Dicer e Drosha para formar microRNAs. As modificações epigenéticas abrangem metilações de DNA nas citosinas em ilhas CpG e modificações das histonas por metilação ou acetilação dos resíduos de lisina. Pensa-se que os NATs e, mais amplamente, ncRNAs, afetam a metilação do DNA, interagindo com vários tipos de proteínas envolvidas na modificação de histonas ou na remodelação da cromatina como o “Polycomb repressive complex 2” (PRC2). Estas interações, por competição, podem impedir a ligação deste complexo a transcritos “sense”. Este complexo também pode impedir a interação do gene “sense” com a RNA Pol II ou até mesmo com a cromatina. Além disso, mais recentemente, os NATs foram descritos como podendo controlar a “stemness” e a diferenciação celular. Um estudo muito recente também revelou que a transcrição anti “sense” pode ser uma nova forma de regular a eficiência da reprogramação das células envelhecidas e na conservação de características pluripotentes. Este estudo mostrou que um lncRNA sobreposto e anti “sense” ao locus Zeb2, regula a expressão da proteína do Zeb2 (zinc finger E-box binding homeobox 2) em fibroblastos de ratinhos e células estaminais embrionárias. O Zeb2 é um fator de transcrição, repressor da E-caderina, e é responsável pela ativação da transição epitelial para mesenquimal (EMT). Isto é de extrema importância, uma vez que o mecanismo oposto, a transição mesenquimal-epitelial (MET), é um mecanismo necessário durante a reprogramação celular de fibroblastos. Neste estudo verificou-se que os fibroblastos de ratinhos velhos expressam níveis mais altos de Zeb2 quando comparados aos fibroblastos de ratinhos jovens, o que está correlacionado com seu reduzido potencial de reprogramação. De acordo com esta observação, este estudo mostrou que ao reduzir os níveis de Zeb2-NAT, também os níveis da proteína de Zeb2 diminuem, o que resulta numa maior facilidade de reprogramação de fibroblastos obtidos de ratinhos velhos em iPSCs. Além disso, também foi visto que a expressão do Zeb2-NAT é rapidamente aumentada quando as células estaminais embrionárias recebiam estímulos de diferenciação e que o silenciamento deste transcrito anti “sense” era o suficiente para manter as células estaminais embrionárias num estado de auto-renovação e pluripotência. Embora este estudo se foque no papel fisiológico ao manipular a expressão do Zeb2 NAT perante o gene codificante para proteína Zeb2, o mecanismo pelo qual isto ocorre ainda não é totalmente compreendido. O local de início da transcrição do Zeb2 NAT está localizado no primeiro intrão do Zeb2 e a transcrição sobrepõe o local de “splicing” do pré-mRNA Zeb2. Uma hipótese é que como consequência direta desta sobreposição, a expressão de Zeb2 NAT impede a excisão do primeiro intrão do Zeb2 que possui um “internal ribossamal entry site” (IRES) que permite a tradução correta da proteína. Nos ratinhos, o que foi mostrado é que, comparado com os fibroblastos embrionários de ratinho, os fibroblastos de ratinhos velhos têm níveis mais altos de Zeb2 NAT, o que está correlacionado com níveis mais altos de transcritos e proteínas de Zeb2. No entanto, o aumento dos transcritos que retêm o primeiro intrão é paralelo ao aumento dos transcritos de Zeb2 com o intrão 1 excisado, aumentando a possibilidade de um aumento da transcrição do Zeb2 consoante a idade. Além disso, o mesmo estudo também mostrou que silenciar o Zeb2 NAT, resultava numa redução significativa dos níveis de mRNA do Zeb2 e de transcritos do Zeb2 com retenção do intrão 1, sugerindo que uma regulação negativa do Zeb2 NAT, resulta em níveis mais baixos de transcritos nascentes de Zeb2. Com base nestas observações que indicam que níveis mais altos de Zeb2 NAT estão positivamente correlacionados com o aumento dos níveis de transcritos de Zeb2; colocámos a hipótese de que o Zeb2 NAT está envolvido na regulação da transcrição de Zeb2. O objetivo deste projeto foi testar esta hipótese e dissecar o mecanismo usado por este transcrito anti “sense” para regular a transcrição do gene “sense” correspondente. Como modelo de estudo, usei a linha celular de cancro da mama de ratinho 4T1 pois esta expressa tanto Zeb2 como Zeb2-NAT. Começou-se por analisar o efeito na expressão do Zeb2 ao transfectar estas células com dois oligonucleotídos de 2 ′ OMe RNA mimetizando o Zeb2-NAT. O objetivo era sobreexpressar o Zeb2 NAT e determinar se isso afetaria os níveis de Zeb2. No entanto, esta abordagem não produziu nenhum efeito nos níveis de transcritos de Zeb2 nascentes. Como os níveis totais de Zeb2 NAT não foram afetados pela transfecção dos oligonucleotídos 2’OMe, e não há como controlar a eficiência das transfecções, não foi possível tirar conclusões. Como alternativa, decidimos clonar o gene Zeb2 NAT num vetor de expressão eucarióta para transfecção transitória em células 4T1. No entanto, apesar das várias tentativas, a clonagem não teve êxito. Assim, em vez de sobreexpressar o Zeb2 NAT em trans, através da transfecção dos oligonucleotídeos de RNA 2’OMe que imitam o Zeb2 NAT ou através da transfecção de um plasmídeo que codifica o gene Zeb2 NAT, decidimos aumentar a sua expressão em cis através da ativação de seu promotor endógeno. Para isso usei uma técnica recente denominada de mediador de ativação sinérgica CRISPR / Cas9 (SAM) ou CRISPR-SAM, que utiliza um complexo CRISPR-Cas9 modificado, capaz de mediar a ativação transcricional eficiente em loci genómicos endógenos através ativadores de transcrição guiados por RNA. Após confirmar que o CRISPR-SAM funciona na ativação de promotores endógenos com um aumento notório nos níveis de expressões génica, prosseguimos com as experiências de ativação do promotor endógeno do Zeb2 NAT para avaliar o papel desse lncRNA na regulação do gene correspondente. Diferentes guias de RNA foram desenhadas tanto para a cadeia “template” como para a cadeia “non template” de forma a direcionar o complexo de CRISPR-SAM para a região promotora do Zeb2 NAT. A análise dos níveis de mRNA do Zeb2 NAT após a transfecção de CRISPR-SAM com as guias de RNA para a cadeia “non template” da região promotora do Zeb2 NAT, mostraram um aumento nos níveis de mRNA com dois dos guias de RNA testados. Isto demonstra que o CRISPR-SAM foi capaz de ativar a transcrição do Zeb2 NAT. Quando os níveis de Zeb2 foram analisados para determinar o efeito da ativação transcricional do Zeb2 NAT na transcrição de Zeb2, pudemos ver que os níveis de mRNA de Zeb2 também foram aumentados com os mesmos guias de RNA. Estes resultados no seu conjunto mostram que o RNA Zeb2 NAT anti “sense” não codificante pode funcionar como um regulador da transcrição do gene codificante para proteína Zeb2 conforme descrito na nossa hipótese.Custódio, Noélia Maria FernandesRodrigues, Elsa Margarida TeixeiraRepositório da Universidade de LisboaGuedes, Miguel Francisco Cruz Romano2022-12-18T01:31:09Z2019-12-182019-11-222019-12-18T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/43692TID:202382206enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:20:50Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/43692Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:09:22.563868Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse |
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