Ammonia toxicity in zebrafish (Danio rerio) - Páscoa, Maria Inês de Almeida (2017)
Nos peixes, a amónia é um composto tóxico produzido durante o catabolismo dos aminoácidos mas, no meio aquático, a sua acumulação deve-se a várias fontes naturais e antropogénicas. Nos teleósteos, a amónia é produzida no fígado, sendo posteriormente eliminada pelas brânquias através do transporte transcelular realizado pelas glicoproteínas Rh, mas também através do transporte paracelular. Independentemente do mecanismo, a amónia atravessa a membrana branquial seguindo o gradiente de difusão que é mantido pela camada acídica presente junto do epitélio. Devido à sua toxicidade, a acumulação de amónia no organismo desencadeia vários efeitos negativos sendo a sua maioria no sistema nervoso central. Para evitar esses efeitos, os peixes desenvolveram mecanismos para reduzir a intoxicação da amónia e garantir a sua sobrevivência. O peixe-zebra (Danio rerio) é uma espécie modelo com características particulares e cujo genoma se encontra sequenciado, sendo por isso uma espécie muito usada em investigação. Contudo, muito ainda está por se saber sobre a toxicidade e excreção da amónia nesta espécie. Posto isto, os principais objetivos desta tese são determinar 1) as concentrações letais durante o desenvolvimento do peixe-zebra, 2) as alterações no transcriptoma da brânquia, fígado e cérebro deste peixe após exposição a uma concentração sub-letal durante 96 h, 3) quais os mecanismos usados pelos adultos para evitar a intoxicação pela amónia e, finalmente, 4) qual o papel do sistema endócrino na excreção e/ou toxicidade da amónia. Assim, foram realizadas experiências de LC50 para todo o ciclo de vida desta espécie, sendo que nos adultos também se testou a sua tolerância perante diferentes condições ambientais. Posteriormente, realizou-se uma experiência de exposição à amónia, durante 96 h, sendo que no final, a brânquia, fígado e cérebro dos peixes foram recolhidos e analisados num 44k Microarray da Agilent. Os genes com diferenças estatísticas foram utilizados numa análise da ontologia dos genes e das via metabólicas recorrendo a ferramentas on-line, mas também numa análise detalhada da expressão de genes envolvidos em mecanismos que evitam a intoxicação da amónia. Por fim, e considerando a resposta do sistema endócrino à exposição à amónia, experiências sobre a taxa de excreção de amónia após a administração da prolactina e do cortisol foram também realizadas, tanto em condições controlo como após administração de amónia. Os resultados mostraram que as fases do desenvolvimento embrionário do peixe-zebra são os mais tolerantes à amónia, e que os adultos, quando comparados com os de água salobra (6 ‰) ou tamponada, apresentam menor sensibilidade do que quando expostos a água doce. Quanto à exposição dos adultos à amónia, verificou-se que estes alteraram o transcriptoma do fígado (2,169 sondas) e cérebro (669 sondas), mas principalmente da brânquia (7,001 sondas). Uma das respostas desta espécie consistiu na alteração das vias de fornecimento de energia, tendo sido os carboidratos preferencialmente usados aos lípidos. Dentro do metabolismo dos carboidratos, a via da glicólise/gluconeogénese foi usada para produzir glucose no fígado e energia na brânquia, o que permitiu a continua excreção de amónia contra gradiente principalmente através de transportadores que consomem energia e cuja expressão também se encontrou aumentada (p.ex. H+-ATPase e Na+/K+-ATPase). Por outro lado, a entrada da amónia no organismo foi impedida, uma vez que se verificou um aumento da expressão dos elementos do transporte paracelular (p.ex. claudinas, ocludinas e tight junctions) e, consequentemente, redução da permeabilidade branquial. Para além disto, o ciclo, crescimento, proliferação e diferenciação celular também foram alterados, para reduzir a energia gasta na replicação celular e para eliminar as células danificadas pela amónia. No peixe-zebra, enquanto que o fígado recorreu à incorporação da amónia em novos aminoácidos, a brânquia reduziu a sua produção através da diminuição da expressão das enzimas envolvidas no mesmo metabolismo. Relativamente ao sistema endócrino, a hormona somatolactina e vários receptores hormonais (receptor da prolactina, da hormona do crescimento, da tiroide, da paratiroide e péptido natriurético) responderam à exposição à amónia, o que sugere que este sistema é importante para repor a homeostasia do peixe. No entanto, ao contrário do esperado, a prolactina não induziu taxas de excreção de amónia similares ou inferiores às do cortisol que, por sua vez, permitiu taxas de excreção muito baixas. De facto, e embora ambas as hormonas tenham alterado a permeabilidade da brânquia, aumentando a expressão das ocludinas, apenas o tratamento com cortisol aumentou os níveis de transportadores de amónia. A disparidade destes resultados são discutidos nesta tese. Concluindo, apesar da amónia não causar nenhum efeito visível nos peixes, ela pode causar efeitos a nível molecular, comprometendo a geral função do organismo e levando, posteriormente, à sua morte. Neste sentido, e tal como tem sido descrito noutras espécies, o peixe-zebra desenvolveu estratégias para ultrapassar a toxicidade da amónia e inclusivé recorreu ao sistema endócrino para garantir a sua homeostase e sobrevivência. Este estudo é portanto relevante especialmente para aquaculturas e para monitorização ambiental.