Bioreconhecimento de DNA minicircular por derivados de aminoácidos imobilizados em suportes monolíticos - Pais, Vânia Nascimento (2016)
Atualmente existem diversas patologias que afetam a sociedade, cujas terapias disponíveis não são adequadas, vitimando uma parte da população. A terapia génica e as vacinas de DNA são uma alternativa promissora que visa a administração de DNA que permite que o organismo expresse dada proteína/informação necessária para o tratamento da doença. Os plasmídeos têm sido o meio de entrega do DNA não viral mais utilizados, contudo são constituídos por genes necessários para a produção e replicação nos respetivos hospedeiros que quando administrados em humanos podem causar respostas inflamatórias e imunitárias. Neste contexto, surge o DNA minicircular (mcDNA) como uma tecnologia altamente promissora visto que é constituído unicamente pelos genes de expressão eucariota, necessários para a expressão do gene terapêutico. O mcDNA é por isso considerado um vetor de DNA mais seguro e está associado a um elevado efeito terapêutico, sendo necessário o desenvolvimento de metodologias eficientes para a sua purificação. Neste projeto foi usada a cromatografia de afinidade com derivados de aminoácidos (agmatina e histamina) como ligandos, para estabelecer um método eficaz de purificação do mcDNA. Para o alcance dos melhores resultados possíveis quando aplicada cromatografia de afinidade é essencial um conhecimento minucioso do tipo de interações que se estabelecem entre a amostra injetada e os derivados de aminoácidos estudados. Neste estudo, verificou-se que para o caso da agmatina estabelecem-se maioritariamente interações eletrostáticas para valores de pH inferiores ao pKa e que estas são intensificadas com a diminuição do pH. Observou-se também uma preferência por parte do monolito para a isoforma sc provavelmente devido à maior exposição das bases que assim permite que se intensifiquem outras interações como interações catião-p e interações por pontes de hidrogénio entre as aminas da agmatina e preferencialmente as guaninas da isoforma sc do mcDNA. Relativamente à histamina, apesar de não se ter conseguido estabelecer uma estratégia de purificação, foi também estudado um possível bioreconhecimento do mcDNA para com este derivado de aminoácido. E observou-se que quando utilizado NaCl há também uma preferência por interações eletrostáticas quando aplicados valores de pH inferiores ao pKa, pois assim o ligando apresenta uma carga global positiva que, por conseguinte, interage fortemente com a carga negativa do DNA conferida pelos grupos fosfato. Relativamente à estratégia de eluição com recurso a sulfato de amónio não foi concretizável visto que não se conseguiu obter seletividade, no entanto esta estratégia é menos interessante do ponto de vista industrial dada a implicação ambiental negativa associada ao sulfato de amónio. Após o estudo das diversas condições definiu-se que o suporte mais promissor para a purificação do mcDNA era o monolito modificado com agmatina, usando como gradiente a estratégia por passos com as seguintes concentrações de NaCl: 0 M, 1,5 M, 2,25 M e 2,7 M em 10 mM de tampão Tris-HCl. A biomolécula de interesse eluiu a 2,7 M de NaCl, no entanto verificou-se uma grande perda desta nos passos anteriores. Contudo, neste tipo de estudo, por vezes é necessário comprometer a recuperação de modo a conseguir a pureza adequada. Desta forma, a estratégia desenvolvida neste trabalho permitiu uma separação eficaz da isoforma sc do mcDNA, embora se tenha comprometido parte da biomolécula de interesse nos passos iniciais. De uma forma sucinta, a utilização do suporte monolítico modificado com agmatina pode ser uma solução para a purificação da isoforma sc do mcDNA para uma posterior aplicação terapêutica.