Obtenção de vacina de DNA plasmídico HPV-16 E6/E7 e avaliação da sua imunogenicidade in vitro e in vivo

• Main Author: Almeida, Ana Margarida Cardoso Valério de
• Publication Date: 2014
• Format: Master thesis
• Language: por
• Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Download full: http://hdl.handle.net/10400.6/5628
• topic: Cromatografia de Afinidade; Desenho Experimental; Plasmídeo Hpv16-E6/E7 Superenrolado; Transfeção; Vacinas de Dna.

A constante evolução da ciência tem permitido uma melhor partilha de conhecimentos na área da tecnologia do DNA recombinante, fornecendo um melhor conhecimento da informação contida nos genes e o impacto que alterações nesses genes poderão ter no organismo. A descodificação do genoma humano aliada ao progresso obtido no desenvolvimento de variados vetores de transporte de informação genética permitiu a evolução de terapias baseadas na entrega de genes terapêuticos, como a terapia génica e as vacinas de DNA. O desenvolvimento destas terapias trouxe uma nova esperança para o tratamento de certas patologias que, até então, permaneciam como intratáveis. Vetores biológicos e não biológicos têm evoluído largamente nos últimos anos, no entanto, a toxicidade demonstrada pela maioria dos vetores biológicos tem levado a um aumento de utilização de vetores não biológicos. O DNA plasmídico destaca-se entre os diversos vetores genéticos devido à simplicidade da sua produção, obtenção, baixo custo e ausência de toxicidade. As vantagens deste vetor têm levado a que a sua utilização como vacina de DNA tenha aumentado nos últimos anos, tornando-o o vetor de escolha na maioria dos estudos de investigação. As vacinas de DNA têm como modo de atuação a expressão de proteínas antigénicas com o objetivo de induzir uma resposta imunitária direcionada para essas mesmas proteínas, permitindo a prevenção e/ou tratamento de infeções virais e bacterianas. Torna-se imperativo o desenvolvimento de tecnologias que permitam a produção e purificação destes vetores, obtendo a maior percentagem de recuperação e pureza possíveis do plasmídeo na sua forma biologicamente ativa, a isoforma superenrolada (sc). A área da cromatografia tem progredido bastante no desenvolvimento de estratégias eficazes de purificação de plasmídeo, permitindo o aumento de produtividade e obtenção deste vetor e diminuindo eventuais custos associados à sua produção. O Vírus do Papiloma Humano (HPV) é um vírus sexualmente transmissível que se encontra atualmente associado ao desenvolvimento de massas tumorais devido à produção de duas proteínas oncogénicas, oncoproteínas E6 e E7, capazes de alterar o ciclo de proliferação celular e de provocar o crescimento anormal de células do organismo infetado. A tecnologia de vacinas de DNA apresenta-se assim como uma terapia promissora para infeções provocadas pelo HPV, através da indução de uma resposta imunitária contra as proteínas referidas. Recentemente, o nosso grupo de investigação conseguiu desenvolver de forma eficaz a produção e purificação da vacina de DNA sc HPV-16 E6/E7 através da utilização de um monolito modificado com ligandos de arginina, tirando partido dos princípios básicos da cromatografia de afinidade. Contudo, a recuperação do plasmídeo não foi a esperada, tendo sido apenas recuperado 39% da molécula alvo. O Desenho experimental é uma ferramenta estatística que, através da escolha correta dos fatores a serem avaliados, bem como os seus intervalos em estudo, permite a otimização de respostas de um sistema experimental. Deste modo, através do design experimental foi feita uma otimização ao sistema de purificação da vacina de DNA sc HPV-16 E6/E7 de modo a garantir um aumento de recuperação da molécula, mantendo o elevado nível de pureza. Com esse intuito, após uma avaliação inicial dos fatores e dos intervalos a serem usados, o design ‘Central Composite Face’ (CCF) foi utilizado para delinear um conjunto de experiências cromatográficas de modo a encontrar o ponto ótimo para a percentagem de recuperação do plasmídeo ser maximizada. A otimização foi bem-sucedida, permitindo a obtenção de uma percentagem de recuperação de cerca de 83%, mantendo-se a percentagem de 100% para a pureza. Após a otimização da estratégia de purificação, estudos de transfeção in vitro foram realizados de modo a avaliar a capacidade de transfeção celular e consequente expressão da proteína codificada pelo gene-alvo contido na vacina de DNA. Células CHO-1, isoladas a partir de tecido ovárico de rato chinês, foram cultivadas e transfetadas com a isoforma sc purificada através da estratégia otimizada com o monolito de arginina, bem como com a isoforma circular aberta (oc) e DNA plasmídico obtido através de um kit comercial, de modo a avaliar qual a melhor estratégia para transfeção. Através das técnicas de western blot e imunocitoquímica foi possível verificar que a entrada do pDNA nas células eucarióticas ocorreu com sucesso (processo de transfeção), observando-se um aumento significativo de expressão génica das proteínas E6 e E7 em comparação ao grupo de controlo (células não transfetadas). A avaliação da expressão génica da proteína E6 dos diferentes tipos de plasmídeos utilizados permitiu verificar que o aumento de expressão desta proteína foi mais significativo com a amostra de plasmídeo sc purificado pelo monolito de arginina, concluindo-se que de facto a isoforma sc induz uma maior eficiência de transfeção.