Avaliação da atividade de efluxo em Staphylococcus pseudintermedius e a sua relação com a suscetibilidade reduzida a agentes antimicrobianos - LEAL, Marta Sofia Pires (2022)
Staphylococcus pseudintermedius é o principal agente bacteriano de infeções de pele e tecidos moles (SSTIs) em animais de companhia, particularmente no cão. A emergência de estirpes de S. pseudintermedius resistentes à meticilina (MRSP), muitas vezes associadas a um fenótipo de multirresistência, é considerada um problema de saúde pública. Neste trabalho pretendeu-se avaliar a atividade de efluxo como um mediador da suscetibilidade reduzida a biocidas e resistência a fluoroquinolonas, aspetos ainda pouco caracterizados em S. pseudintermedius. Para isso, estudou-se uma coleção de 155 estirpes de S. pseudintermedius associadas a SSTIs em animais de companhia. A suscetibilidade aos substratos de bombas de efluxo brometo de etídio (EtBr), brometo de tetrafenilfosfónio (TPP) e ciprofloxacina (CIP) foi avaliada por determinação de concentrações mínimas inibitórias (CMI). As distribuições de CMIs foram analisadas e usadas para estimar valores de cut-off (COWT) para o EtBr e TPP, utilizando o programa ECOFFinder. A presença de atividade de efluxo aumentada foi avaliada para estirpes representativas por (i) re-determinação das CMIs na presença dos inibidores de efluxo (IEs) tioridazina e verapamil e (ii) ensaios de acumulação de EtBr em tempo real, na presença/ausência de glucose e presença/ausência de IEs. Foram determinados os níveis de expressão do gene norA, que codifica para a bomba de efluxo NorA, em seis estirpes representativas, por RT-qPCR. Foi ainda pesquisada a presença de mutações nos genes grlA e gyrA, que codificam para os alvos das fluoroquinolonas. A aplicação do COWT estimado permitiu detetar uma população non wild type de S. pseudintermedius para o TPP (TPPNWT), correspondendo a 11,6% (18/155) da coleção. O efeito dos IEs foi avaliado nestas 18 estirpes TPPNWT e em 12 estirpes TPPWT (wild type), tendo-se observado uma redução significativa da CMITPP na população TPPNWT para valores equivalentes aos apresentados pela população WT. Os ensaios de fluorometria aplicados, que seja do nosso conhecimento, pela primeira vez nesta espécie, confirmaram a maior atividade de efluxo nas estirpes TPPNWT, a qual foi inibida pelos IEs. Entre os dois IEs testados, o verapamil apresentou maior atividade inibitória de efluxo. A análise dos níveis de expressão de norA relacionou a sobreexpressão deste gene com a maior atividade de efluxo numa das estirpes TPPNWT. Relativamente à ciprofloxacina, não foram observados efeitos significativos dos IEs sobre os valores de CMICIP na população TPPNWT, maioritariamente resistente às fluoroquinolonas. A deteção de mutações QRDR (GrlA:Ser80Ile/GyrA:Ser84Leu) nestas estirpes indica que em S. pseudintermedius o principal mecanismo de resistência a esta classe de antibióticos será mutação do alvo. Este trabalho revelou a presença de suscetibilidade reduzida ao biocida TPP, potencialmente mediada por bombas de efluxo MDR, em 11,6% desta coleção de S. pseudintermedius. Salienta-se ainda a associação deste fenótipo a estirpes MRSP, as quais apresentam adicionalmente multirresistência. Esta Dissertação realça assim a relevância do efluxo como mediador da suscetibilidade reduzida a biocidas em S. pseudintermedius, descrevendo uma abordagem experimental que poderá ser explorada na vigilância da resistência mediada por efluxo neste importante agente patogénico de animais de companhia.