Characterization of the Impact of Caffeine in Radial Migration During Corticogenesis - Lateralization in Brain Development

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Main Author: Pinto, Ricardo José Mesquita
Publication Date: 2024
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: https://hdl.handle.net/10316/117410
Summary: Dissertação de Mestrado em Neurociências Molecular e de Translação apresentada à Faculdade de Medicina
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spelling Characterization of the Impact of Caffeine in Radial Migration During Corticogenesis - Lateralization in Brain DevelopmentCaracterização do Impacto da Cafeína na migração radial durante a corticogébese - Lateralização no Desenvolvimento do CérebroCorticogenesisRadial MigrationCaffeineAdenosine ReceptorLateralizationCorticogéneseMigração RadialCafeínaRecetores de AdenosinaLateralizaçãoDissertação de Mestrado em Neurociências Molecular e de Translação apresentada à Faculdade de MedicinaCaffeine is the most consumed psychoactive drug. Caffeine consumption during pregnancy is associated with low birth weight, fetal growth restriction, childhood obesity, and spontaneous abortion. Despite these effects of caffeine, its impact in brain development is poorly defined.Caffeine has a well-established antagonistic action on adenosine receptors (P1R), a family of metabotropic G-protein coupled receptors comprising A1R, A2AR, A2BR and A3R. During brain development, A2AR was shown to be involved in both radial and tangential neuronal migration, and synapse stabilization. While caffeine mimicked the delay in tangential migration observed with the blockade of A2AR, our unpublished results have shown in mice that caffeine consumption at E13.5-E17.5 accelerated radial migration, in contrast to the observed with A2AR antagonism, indicating the involvement of other P1R(s) in radial migration of cortical projection neurons. Importantly, this effect was observed selectively in one of the hemispheres, providing, to the best of our knowledge, the first evidence for the existence of unilateral mechanism(s) governing brain development, in particular corticogenesis, raising the concept that different hemispheres and different functions are underlined by different developmental mechanisms. Hence, in this study we started to evaluate the putative expression of the P1Rs other than A2AR, i.e. A1R, A2BR, A3R, suggested to be also involved in radial migration by the opposite effect of caffeine in relation to the observed with the antagonism of A2AR. For that purpose, we evaluated the immunoreactivity of each receptor in total protein extracts from the forebrain of mice embryos at E14.5 and E16.5. We could detect predominantly A1R, but also A2BR and A3R. Moreover, we could determine no differences in the densities of A1R and A3R between hemisphere, but a higher density of A2BR in the left hemisphere. Yet, when assessing the A1R, it was found two populations, one with increased density in the right hemisphere, and another with increased density in the left hemisphere. Next, it was characterized the regional distribution of each receptor in mice developing cortex at E14.5 and E16.5 by immunohistochemical analysis. It was detected immunoreactivity for all three receptors both at E14.5 and E16.5. Regarding their regional distribution, at E14.5, the three receptors display a similar regional distribution across the developing cortex, peaking at the upper intermediate zone (IZ). At E16.5, while A2BR displays a similar regional profile, A1R displays a higher expression at the proliferative regions and at the cortical plate (CP), and lower levels at the IZ, in contrast to the observed at E14.5. Regarding A3R, its levels peak at the upper IZ, but remains high in the CP. When comparing the immunoreactivities for each receptor obtained in each hemisphere, we did not find any statistical significant differences both at E14.5 and E16.5 with 3-5 mice embryos analysed. Yet, at E14.5 there is a tendency for higher levels of A1R in the left hemisphere and higher levels of A2BR and A3R in the right hemisphere, whereas at E16.5 the levels of A1R seem to be higher in the right hemisphere and of A2BR higher in the left hemisphere. This set of data, although it does not clearly identify inter-hemispheric differences, it demonstrates the presence of A1R, A2BR and A3R at mid-late embryogenesis in mice developing cortex, and a spatial-temporal dynamics of expression. Next, we evaluated the impact of caffeine in radial migration as previously, by promoting caffeine intake by pregnant mice through drinking water (0.3 g/L) between E13.5-E17.5 and accessing migrating cells by BrdU labelling injected at E14.5. The distribution of BrdU+-migrating neurons in each region was gauged by immunohistochemical analysis identifying the different layers, ventricular zone/subventricular zone (VZ/SVZ), lower IZ, upper IZ and CP, through the immunolabelling of TAG-1 (IZ marker) and SMI32 antibody staining (upper IZ marker). It was found no differences in radial migration between the embryos from the Caffeine group in comparison with the control (water) group, in contrast to the previously observed in our preliminary data. Also, no differences in the migration between the hemispheres were found. However, when assessing BrdU+-cell density, with 12 embryos for each group analysed, there is a clear tendency for an increase in cell density induced by caffeine intake (p=0.060; n=12). Although a higher number of animals should be analysed, this result indicates for an impact of caffeine intake in cell proliferation from the proliferative regions in the pallium during cortical radial migration.Cafeína é a droga psicoativa mais consumida mundialmente. O consumo de cafeína na gravidez está associado a baixo peso ao nascimento, restrição de crescimento intrauterino, obesidade infantil e aborto espontâneo. Apesar destes efeitos nefastos da cafeína, o seu impacto no desenvolvimento do cérebro ainda é pouco claro.A cafeína é um antagonista bem estabelecido dos recetores de adenosina (P1R), a família de recetores metabotrópicos acoplados a proteína G que abrange o A1R, A2AR, A2BR e A3R. Durante o desenvolvimento do cérebro, o A2AR foi implicado tanto na migração radial e tangencial como na estabilização de sinapses. Enquanto a cafeína mimetizou o efeito do bloqueio do A2AR na migração tangencial, os nossos resultados não publicados mostraram que em murganhos que consumiram cafeína durante a gestação de E13.5 a E17.5 a migração radial foi acelerada, em contraste com o observado com o antagonismo do A2AR, indicando o envolvimento de outro(s) P1R na migração radial de neurónios piramidais corticais. Para além disso, o efeito foi observado seletivamente em apenas um dos hemisférios, provando ser, para o nosso conhecimento, a primeira evidência da existência de mecanismo(s) unilateral de desenvolvimento do cérebro, em particular corticogénese, levando ao conceito que por detrás de diferentes hemisférios e diferentes funções estão diferentes mecanismos de desenvolvimento. Tendo isto em conta, esta tese começou por avaliar a expressão dos P1Rs para além do A2AR, ou seja, A1R, A2BR e A3R, que presume-se terem envolvimento na migração radial pelo efeito oposto da cafeina em relação ao observado no antagonismo do A2AR. Para este propósito nós avaliamos a imunorreatividade de cada recetor em extratos de proteína total do prosencéfalo de embriões de murganhos a E14.5 e E16.5. Conseguimos detetar predominantemente A1R, mas também A2BR e A3R. Para além disso, conseguimos determinar que não houve diferenças na densidade de A1R e A3R entre hemisférios, no entanto o A2BR apresenta uma maior expressão no hemisfério direito. Apesar dito, ao avaliar o A1R, encontrámos duas populações, uma com aumento de expressão no hemisfério direito e outra com aumento de expressão no hemisfério esquerdo. Posteriormente, caracterizamos a distribuição regional de cada recetor no córtex em desenvolvimento a E14.5 e E16.5 por análise de imunohistoquímica. Detetamos imunoreactividade dos três recetores tanto a E14.5 como a E16.5. Em termos da distribuição regional, os três recetores apresentam distribuições semelhantes a E14.5, tendo o pico de expressão na zona intermediária (IZ). A E16.5, enquanto o A2BR demonstrou um perfil de expressão semelhante, o A1R apresentou um aumento de expressão na zona proliferativa e na placa cortical (CP), e uma expressão baixa na IZ, em contraste ao observado a E14.5. No que respeita ao A3R, os seus níveis de expressão atingem o pico da IZ superior, mantendo-se altos na CP. Comparando o nível de expressão de cada recetor entre cada hemisfério, não encontramos nenhuma diferença estatisticamente significativa tanto a E14.5 como a E16.5 com 3-5 embriões analisados. No entanto, a E14.5 existe uma tendência para níveis de expressão mais altos do A1R no hemisfério esquerdo e níveis de expressão mais altos do A2BR e A3R no hemisfério direito, enquanto a E16.5 os níveis de A1R parecem ser superiores no hemisfério direito e os de A2BR superiores no hemisfério esquerdo. Estes resultados, apesar de não identificarem claramente diferenças entre os hemisférios, demonstram a presença de A1R, A2BR e A3R na embriogénese média a tardia no córtex em desenvolvimento de murganhos, e uma dinâmica espácio-temporal de expressão.A seguir, avaliamos o impacto da cafeína na migração radial como previamente, ao administrar cafeína a murganhos durante a gestação na água (0.3 g/L) entre E13.5-E17.5 e avaliar a migração de células através de injeção de BrdU a E14.5. A distribuição de neurónios migratórios que expressavam BrdU em cada região foi avaliado por análise imunohistoquímica identificando as diferentes camadas corticais, nomeadamente a zona ventricular/zona subventricular (VZ/SVZ), IZ inferior, IZ superior e CP, através de identificação dos marcadores TAG-1 (marcador da zona intermediária) e SMI-312 (marcador da IZ superior).Não encontramos diferenças na migração radial entre embriões do grupo da cafeína e grupo de controlo (água), em contraste ao previamente observado nos nossos resultados preliminares. Para além disso, não encontramos diferenças na migração entre hemisférios. No entanto, quando analisamos a densidade de células que expressam BrdU, com 12 embriões por grupo, verificamos tendência clara para um aumento de densidade de células induzida pela cafeína (p=0.060; n=12). Apesar ser necessário aumentar o número da amostra, este resultado indica um impacto do consumo de cafeína na proliferação celular das regiões proliferativas do pálio durante a migração radial cortical.FCTFCTFCTOutro - European Regional Development Fund (ERDF) através do Centro 2020 Regionnal Operation program sobre o projeto CENTRO-01-0145-FEDER-000008: BrainHealth20202024-10-282030-10-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttps://hdl.handle.net/10316/117410https://hdl.handle.net/10316/117410TID:203770153engPinto, Ricardo José Mesquitainfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-04-02T17:34:08Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/117410Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T06:11:21.518836Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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