Purificação de uma vacina de DNA plasmídico contra o Vírus do Papiloma Humano - Gaspar, Rita Isabel Mota (2015)
O vírus do papiloma humano é um vírus sexualmente transmissível e está associado a cerca de 99% dos casos de cancro do colo do útero. Este cancro é considerado a segunda maior causa de morte em mulheres ao nível mundial. As vacinas comercializadas contra este vírus são apenas preventivas, ou seja, permitem o desenvolvimento de anticorpos de memória caso não exista ainda contato com o vírus. Além disto, apresentam outras limitações, tais como o elevado custo e não protegem contra todos os tipos de vírus do papiloma humano. Desta forma, as vacinas de DNA surgiram como uma estratégia bastante promissora, pois estas vacinas têm a capacidade de induzir dois tipos de resposta, a resposta humoral e a resposta celular, evitando assim a progressão da doença. As vacinas de DNA plasmídico requerem uma etapa de produção e uma etapa de purificação para obter apenas a isoforma superenrolada, pois é a isoforma biologicamente ativa e de interesse terapêutico. Para a etapa de purificação, têm sido desenvolvidas novas estratégias para aplicação em processos cromatográficos que apresentem elevada eficiência na separação da biomolécula de interesse. Uma das estratégias recentemente exploradas consiste na utilização de monolitos como colunas cromatográficas que permitem maior capacidade de transferência de massa. Outra das estratégias é a utilização de aminoácidos como ligandos de afinidade, por reconhecerem especificamente a isoforma superenrolada do DNA plasmídico. Desta forma, o trabalho apresentado nesta dissertação baseou-se na utilização de uma coluna monolítica imobilizada com um ligando derivado do aminoácido de histidina (benzil-histidina). O objetivo de explorar este ligando foi estudar as interações que possam ser estabelecidas entre os grupos funcionais do ligando, como os anéis aromáticos de benzil e imidazole, e a isoforma superenrolada do plasmídeo assim como os restantes constituintes do lisado de Escherichia coli. Inicialmente foram realizadas mutações nos genes E6 e E7 do plasmídeo HPV16 E6/E7 para impedir que estas proteínas antigénicas reconheçam as proteínas p53 e retinoblastoma e tenham atividade oncogénica. Posteriormente foram realizados vários ensaios com amostras do plasmídeo mutado obtidas através de um kit comercial, contendo apenas as isoformas superenrolada e circular aberta do plasmídeo, para avaliar o comportamento e seletividade do ligando. Os resultados mostraram que foi possível isolar a isoforma superenrolada com uma concentração de sal de 2 M de sulfato de amónio. Posteriormente, foram realizados ensaios com a amostra complexa de lisado e confirmou-se que é possível purificar a isoforma superenrolada com uma concentração de sal de 1,65 M. Também foram realizados ensaios de dicroísmo circular para avaliar a estabilidade estrutural do plasmídeo superenrolado no processo cromatográfico em função do tampão de eluição utilizado e verificou-se que a estabilidade da isoforma superenrolada se mantém. Por fim, a qualidade e percentagem de pureza do plasmídeo resultante da purificação com o monolito de benzil-histidina foram avaliadas através das metodologias requeridas pelas agências reguladoras, como a “Food and Drug Administration”. Estes testes indicaram que a amostra purificada de DNA plasmídico superenrolado apresenta 99% de pureza e está de acordo com os critérios exigidos no que diz respeito ao DNA genómico, proteínas e RNA. Relativamente às endotoxinas foi conseguida uma redução de aproximadamente 344 vezes comparativamente à amostra inicial.