C. albicans Cek1 and Ras1: cloning, expression and purification

• Autor(a) principal: Carvalho, Vanessa Isabel Dias Ribeiro de
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10773/9526
• topic: Biologia molecular; Fungos patogénicos; Candidíase; Candida albicans

Candida albicans é um fungo polimórfico e patogénico que reside de forma comensal nas superfícies mucosas humanas. Este fungo apresenta um código genético ambíguo, uma vez que, o codão universal leucina CUG é predominantemente traduzido como serina (97%), mas também como leucina (3%). A análise de proteínas de C. albicans que contêm resíduos CUG em importantes posições funcionais, revela que a ambiguidade do codão modela a função da proteína e poderá ter um papel determinante nas vias de sinalização associadas a mudanças morfológicas e patogénicas. Com o presente estudo pretende-se investigar o efeito da leucina e da serina nas posições CUG (ambiguidade CUG) na estrutura e função de duas proteínas chave nas vias de sinalização de C. albicans, a Ras1 (GTPase) e a Cek1 (Cinase). Estas regulam a transcrição dos genes associados com mudanças morfológicas, patológicas e, por outro lado, contêm resíduos CUG numa posição estritamente conservada e com relevo funcional. Neste contexto foi possível clonar com sucesso genes sintéticos para os centros ativos da Ras1 e Cek1 (variantes de serina e de leucina para o codão CUG) em vetores que apresentam diferentes caudas de solubilidade (MBP, NusA, Trx, ZTag2 e Gb1). Foram desenvolvidos protocolos de alta expressão bacteriana e de purificação para os domínios ativos Ras1 (ligado à Gb1) e Cek1 (ligado à MBP). A análise dos resultados de purificação analítica e de “Dynamic Light Scaterring” demonstraram que as proteínas recombinantes se apresentam na forma monomérica. Ensaios de cristalização estão a ser realizados esperando-se determinar as estruturas tridimensionais das proteínas por cristalografia de raio-X. As estruturas da Cek1 e Ras1 com leucina e serina nas posições CUG, conjuntamente com uma análise meticulosa da sua estabilidade e função in vitro, irão fornecer informações importantes sobre o papel estratégico da ambiguidade natural do codão.