Avaliação da autenticidade de alheiras de caça por técnicas de biologia molecular - Santos, Cristina Maria Gomes (2011)
O fabrico de enchidos à base de carne representa uma longa tradição na região transmontana, onde são produzidos, sendo muito apreciados pelas suas características organolépticas peculiares e elevado valor cultural. A alheira é um dos produtos tradicionais mais típicos de Portugal. Actualmente, para além da alheira tradicional, produzida à base de carne de porco e/ou de aves (galinha e peru) são comercializadas as alheiras de caça, geralmente com preço mais elevado. Neste tipo de produtos processados, é difícil a diferenciação das carnes utilizadas, pelo que são propícios a adulterações. Para isso, o recurso a técnicas de biologia molecular, em especial a Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR), tem-se mostrado como uma alternativa específica, rápida, sensível e adequada para a identificação de espécies em produtos alimentares. A elaboração desta dissertação visou a avaliação da autenticidade de amostras comerciais de alheiras de caça. Para tal, foi necessária a optimização de técnicas de PCR qualitativa, recorrendo à preparação de amostras binárias contendo as espécies em estudo. Desta forma, foram utilizados primers específicos para a detecção dos genes mitocondriais cytb e rARN 12S. Dentro dos primers escolhidos, alguns foram propostos pela primeira vez neste trabalho, com especial destaque para a lebre. Os resultados demonstraram elevada especificidade e sensibilidade das reacções para as espécies em estudo, permitindo detectar a adição de faisão, perdiz, pato, coelho, vaca e lebre em carne de porco até ao limite de 0,01% e adição de veado em carne de porco até ao limite de 0,1%. No caso da detecção de galinha e peru, obteve-se um limite de detecção de 0,01% e 0,1%, respectivamente. No entanto, foi verificada alguma reactividade cruzada, pelo que estas duas técnicas deverão ser optimizadas com novos primers. As metodologias propostas foram aplicadas com sucesso a 18 amostras comerciais de alheiras de caça, tendo-se detectado várias inconsistências na rotulagem, nomeadamente a ausência de espécies de caça declaradas (faisão, perdiz, pato, veado, lebre e coelho) e a presença de carnes não rotuladas (vaca, galinha e peru). A lebre mereceu neste estudo um destaque importante por não terem sido encontrados estudos anteriores relativamente à identificação específica desta espécie. Pelo que, neste trabalho foram propostas duas técnicas de PCR para a detecção de lebre que permitiram atingir níveis da ordem de 0,01% de carne de lebre em carne de porco. Adicionalmente, por PCR em tempo real com a utilização do novo corante EvaGreen® atingiu-se o limite de detecção absoluto de 0,1 pg, tendo a nova metodologia proposta mostrado ser adequada para quantificação. The manufacture of traditional meat products is a long-established tradition in Northeastern region of Portugal, in particular the case of “alheiras”, which are very popular for its unique organoleptic characteristics. Besides the traditional “alheiras” mainly produced with pork and poultry meat, others are currently available in the market, which are produced with different game meats, such as “alheiras de caça”. Since this kind of meat products are prepared using more expensive meats, they are prone to adulterations due to the economic profit that might result from the replacement or decrease of those high valued meats. Thus, the use of molecular biology techniques, especially Polymerase Chain Reaction (PCR), has become a reliable alternative, rapid in performance, sensitive and suitable for species identification in food. The preparation of this thesis aimed to evaluate the authenticity of commercial samples of “alheiras de caça”. For this purpose, it was necessary to optimize qualitative PCR technique, using the binary mixtures containing the species under study. Specific primers were also used for the detection of mitochondrial genes cytb and 12S rRNA. From the chosen primers, some were available on the literature while others were proposed for the first time in this work, with special emphasis to hare. PCR results revealed high sensitivity and specificity of the primers, allowing detecting the addition of pheasant, partridge, duck, rabbit, cow and hare in pork mixtures down to 0.01% and the addition of deer in pork down to 0.1%. The detection of chicken and turkey using the new designed primers enable positive amplifications until 0.01% and 0.1%, respectively. However, for these reactions it was also observed some cross-reactivity, indicating that the technique should be optimized using different primers. The proposed methods were successfully applied to 18 commercial samples of “alheiras de caça”, being detected several discrepancies in the labeling, including the absence of game species declared (pheasant, partridge, duck, deer, hare and rabbit) and the presence of meat species not labeled (cow, chicken and turkey). In this study, hare meat earned a prominent role due to the lack of reported works regarding specific identification of hare. With the techniques applied to hare detection it was possible to achieve a relative limit of detection (LOD) of 0.01% using qualitative PCR. By the use of real-time PCR with the new EvaGreen dye, an absolute LOD of 0.1 pg was reached, having the novel proposed methodology demonstrated its adequacy for quantification.