Neuroinflammation and neurogenesis in the choroid plexus - Morete, Nádia Patricia Amaral (2014)
Sendo parte integrante do sistema nervoso central, os plexos coroides (CP) são estruturas ramificadas, altamente vascularizadas, com uma camada de células epiteliais secretoras que projetam numerosas vilosidades nos quatro ventrículos do cérebro. Os CP são constituídos por uma monocamada externa de células epiteliais coroidais (CPEC), cuja membrana apical está em contacto direto com o líquido cefalorraquidiano, enquanto que a membrana basal das CPEC se localiza sobre o estroma. O estroma é rodeado por células dendríticas, fibras de colagénio, fibroblastos e células B e T. Neste conjunto, encontram-se células imunitárias inatas cuja função é apresentar antigénios, moléculas que são capazes de iniciar resposta imune, o que sugere que o CP pode desempenhar um papel ativo na proteção imune do cérebro. Durante muito tempo, pensava-se que o cérebro era uma estrutura “imunologicamente privilegiada”, isto é, que o cérebro se encontrasse separado fisicamente do sistema imunitário periférico através da barreira hematoencefálica, não havendo trocas entre o cérebro e o restante organismo. A barreira hematoencefálica em conjunto com a barreira formada pelas CPEC protege o sistema nervoso central contra agentes patogénicos através das junções intercelulares que são compostas por proteínas de integridade de membrana. Estas proteínas permitem ao CP ter capacidade imunitária, uma vez que controlam a permeabilidade celular, impedindo os solutos de água de passar livremente, formando uma fronteira entre os domínios de membrana plasmática apicais e basolaterais, impedindo a passagem de proteínas entre os compartimentos da membrana. Não obstante, a permeabilidade da barreira pode ser influenciada por uma neuroinflamação permanente. A neuroinflamação é caracterizada pela ativação da microglia, stress oxidativo e expressão dos principais mediadores inflamatórios sendo um processo ativo de defesa contra vários insultos, lesões traumáticas e metabólicas, infeções e doenças neurodegenerativas tais como a doença de Alzheimer e de Parkinson. Outro “dogma” das neurociências durante muitos anos foi a não existência de neurogénese, isto é, as células do sistema nervoso não se regeneravam. Contudo, estudos recentes afirmam que o CP, quando sujeito a uma agressão, tem capacidade de formar novas células e estas por sua vez são capazes de se diferenciarem. Assim, neste trabalho propusemo-nos a avaliar o efeito de um insulto neuroinflamatório agudo provocado pelo lipopolissacarídeo (LPS), na neurogénese e na neuroinflamação do CP. Mais especificamente, a resposta inflamatória induzida pelo LPS no CP foi avaliada in vivo, ex vivo e in vitro através da análise de marcadores inflamatórios tais como CD11b, iNOS, expressão de TTR e produção de espécies reativas de oxigénio (ROS) e de óxido nítrico (NO). Avaliámos também o efeito do LPS na neurogénese in vivo e ex vivo através do estudo da presença de diferentes marcadores: NeuN, CD11b e o GFAP. Por fim, verificámos se o LPS teria algum efeito na integridade da membrana. A resposta inflamatória foi analisada: in vivo em CP de ratinhos C57BL/6 injetados com 1,0 mg/kg de LPS e sacrificados 7h depois; explantes de CP de ratos recém-nascidos e de animais com 21 dias que foram posteriormente incubados durante 48h com 0,1 µg/mL de LPS. A produção de ROS, NO e alterações no teor de proteínas do meio extracelular foi avaliada em CPEC e verificou-se um aumento na produção de ROS e NO e um incremento no teor de proteínas totais do meio extracelular, em CPEC. Foi possível verificar, em explantes de CP, um aumento na expressão de CD11b, um marcador de microglia, e GFAP que é utilizado como um marcador de astrócitos, uma diminuição na expressão de NeuN, um marcador de neurónios maduros e não se verificou alterações na expressão de TTR, a principal proteína decretada pelo CP. Foi realizado Western blot para verificar se o CP libertaria TTR para o meio de cultura e se a quantidade desta libertada no meio de cultura das CPEC variava ao longo do tempo, apesar de ter ocorrido libertação de TTR par o meio a sua quantidade manteve-se constante ao longo do tempo. Realizou-se Western blot para verificar se havia alterações na secreção de iNOS por parte do CP, tendo sio possível verificar um aumento significativo da enzima nos plexos incubados com LPS comparados com os controlos. O efeito do LPS na integridade do CP como barreira foi analisado através do estudo da expressão das proteínas ocludina, claudina-1, e-caderina e ZO-1 in vitro em CPEC, a expressão de ocludina e e-caderina foi também estudada ex vivo e in vivo. As imagens de imunocitoquimíca referentes às proteínas de integridade de membrana: ocludina, claudina-1, e-caderina e ZO-1, foram adquiridas num microscópio confocal (Zeiss) e a fluorescência emitida foi quantificada. Os resultados revelaram que as CPEC mantiveram a expressão das suas proteínas de integridade de membrana, depois de um insulto com LPS, contudo a expressão da ocludina e da ZO-1 apresentaram uma redução significativa. Por sua vez os resultados ex vivo não mostraram nenhuma alteração na expressão de ocludina e e-caderina. Os ensaios in vivo confirmaram a expressão de ocludina e e-caderina em CP. Assim, podemos concluir que o CP tem uma resposta ativa à neuroinflamação induzida pelo LPS, o que se comprova pelo aumento das proteínas relacionadas com a resposta imunitária e também com um aumento do stress oxidativo a que as células são sujeitas. Verificou-se também que um insulto neuroinflamatório compromete a diferenciação das células do plexo, havendo decrescimento da neurogénese em todas as experiencias realizadas. Finalmente, outra das conclusões que foi possível conjeturar com este estudo foi, que morfologicamente o CP mantém a integridade da barreira, embora não nos seja possível inferir se esta fica ou não comprometida.