Editing of the ADORA2A gene by CRISPR/Cas9

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Raquel Lagoa Madruga da
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/53885
Resumo: Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021
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spelling Editing of the ADORA2A gene by CRISPR/Cas9Receptor de adenosina A2AADORA2AMemóriaCRISPR/Cas9PolimorfismoTeses de mestrado - 2021Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2021A percentagem de população envelhecida, a nível mundial, tem vindo a aumentar progressivamente, o que, por seu turno, está associado a um aumento das doenças ligadas ao envelhecimento como as doenças cardiovasculares e neurodegenerativas . O envelhecimento, afeta as células de todo o sistema nervoso, causando um declínio das funções sensitivas e cognitivas sendo o principal fator de risco de Doença de Alzheimer (DA), que é a forma mais comum de demência . Entre as estruturas cerebrais, aquelas envolvidas na memória, como o hipocampo, parecem ser particularmente vulneráveis à senescência e degeneração. A DA é caracterizada por deficiências cognitivas progressivas que comprometem progressivamente a memória e aprendizagem e, eventualmente, a capacidade de realizar as tarefas mais simples. Patologicamente, esta doença é caracterizada : i. pela formação sequencial de placas senis (ou neuríticas) extracelulares que resultam da acumulação do péptido β-amilóide (Aβ); ii. Tranças neurofibrilares intracelulares formadas por filamentos de proteína tau hiperfosforilada; iii. Perda sináptica e neuronal seletiva, no hipocampo e córtex cerebral, responsável pela atrofia cerebral; iv. gliose, resultante da ativação e proliferação de células da microglia e de astrócitos. No entanto, os mecanismos pelos quais a patologia da DA afeta a neurogénese não estão completamente compreendidos. A agregação e a acumulação de péptidos Aβ e proteínas tau, inflamação, alterações genéticas nas vias e genes relacionados com a neurogénese podem prejudicar a maturação de neurónios recém-nascidos e inibir a neurogénese do hipocampo, com possível impacto na atrofia do hipocampo . Contudo, até à data, nenhum estudo verificou uma associação entre genes relacionados com a neurogénese e o volume do hipocampo. Foi recentemente descrita uma associação entre um polimorfismo do gene que codifica o recetor de adenosina de subtipo A2A (A2AR) – ADORA2A – com a memória episódica, volume do hipocampo e a tau total no líquido cefalorraquidiano em pacientes com Défice Cognitivo Ligeiro e com DA, sugerindo que esta variante genética pode afetar a produção de A2AR. A adenosina, metabolito presente em todos os subtipos celulares, tem o papel de neuromodulador que influencia a atividade neuronal a diversos níveis, mas também o papel de cotransmissor ou mesmo neurotransmissor . É, portanto, uma molécula sinalizadora extracelular que afeta a transmissão sináptica . Uma vez ligada a recetores acoplados à proteína G, tem a capacidade de atuar a nível pré- e pós-sináptico, inibindo ou facilitando a libertação de neurotransmissores e, afetando a ação de recetores, respetivamente . Os sensores de adenosina – recetores de adenosina – são muito mais abundantes no cérebro do que em qualquer outro órgão ou tipo celular, em mamíferos . São recetores acoplados à proteína G, e dividem-se nos subtipos A1, A2A, A2B e A3, embora sejam principalmente os recetores A1 (A1R) e A2A (A2AR), os responsáveis pelos efeitos da adenosina no cérebro . Os A1R são os mais abundantes e amplamente distribuídos, sendo responsáveis pela diminuição da libertação de glutamato, tendo, portanto um papel neuroprotetor. Por seu turno, os A2AR são mais abundantes nos gânglios basais e nas sinapses, sendo considerados recetores excitatórios, na medida em que facilitam a libertação de neurotransmissores Durante o processo de envelhecimento há um aumento da expressão dos A2AR nas zonas corticais, estando este associado ao aumento dos défices cognitivos. Apesar da baixa expressão e densidade desses recetores no hipocampo, em condições fisiológicas, os A2AR regulam a função metabotrópica, ionotrópica e catalítica de recetores de outros sistemas modulatórios. Assim, os A2AR têm um papel importante na modulação da transmissão sináptica, no hipocampo, portanto, na presença de danos sinápticos e cognitivos, presentes na população envelhecida e nos doentes com DA. Um “single nucleotide polymorphism” (SNP) – rs9608282-T – a montante do gene ADORA2A foi associado a um maior volume do hipocampo e a um melhor desempenho da memória4 , sugerindo que este SNP possa ter um efeito protetor sobre a estrutura e função do cérebro. Rs9608282-T está localizado a montante do gene ADORA2A, numa região caracterizada pelo read-through de dois genes vizinhos, SPECC1L (“sperm antigen with calponin homology and coiled-coil domains 1-like”) e ADORA2A (“adenosina A2A receptor”) no cromossoma 22. Este read-through é um forte candidato para o decaimento mediado por mRNA nonsense, levando, assim, à não produção de proteína. Tendo em conta estudos anteriores, em modelos animais, em que tanto a deleção e/ou a inibição de A2AR levam à melhoria da memória espacial e ao aumento da plasticidade sináptica, pretendemos, então, com este trabalho, explorar a hipótese de que a variação rs9608282-T está associada à inibição da produção de proteína A2AR. Contrariamente aos neurónios, as linhas celulares são capazes de realizar a recombinação homóloga, essencial para a edição genómica, por serem mitoticamente ativas. Deste modo, a primeira fase deste trabalho consistiu em verificar se ambas as linhas celulares, células H4 e células U2OS, eram um bom modelo para o estudo do impacto deste SNP. Primeiramente, avaliou-se se ambas as linhas celulares expressavam níveis detetáveis de mRNA e proteína A2AR por recurso às técnicas de biologia molecular qPCR e Western Blotting. Por último, procedeu-se à caracterização das linhas celulares H4 e U2OS pelo método de Sanger Sequencing. A segunda fase deste trabalho consistiu na indução do SNP descrito com recurso à edição genómica CRISPR/Cas9. Este método usa um RNA guia (gRNA) complementar à sequência de DNA alvo, acoplado a uma endonuclease – Cas9 –, a qual induz quebras na cadeia dupla (DSB) de DNA, nessa sequência alvo. O DNA é reparado por recombinação homóloga (HDR), quando na presença de uma molécula de DNA dador com regiões de homologia correspondentes às sequências a montante e a jusante do local de corte da Cas9. Deste modo, desenhou-se o gRNA, que flanqueia a região a ser modificada, e os dois oligonucleótidos (WT e SNP-) que funcionam como template do DNA dador. Por sua vez, as células H4 e as células U2OS foram transfetadas com o plasmídeo, que contem o gRNA, e com os DNA dadores. De seguida, os mutantes gerados (WT e SNP) em cada linha celular foram validados por PCR e caracterizados pelo método de Sanger Sequencing. A partir dos resultados obtidos, conseguimos validar os modelos in vitro – linha celular H4 e linha celular U2OS –, uma vez que ambas as linhas celulares mostraram expressar níveis detetáveis de mRNA e proteína A2AR e, também mostraram ser wild-type, não apresentando o polimorfismo em estudo. Aquando da edição genómica por CRISPR/Cas9 de ambas as linhas celulares, foi possível verificar que o gRNA foi capaz de induzir DSB, no local pretendido. Os mutantes gerados (WT e SNP) em cada linha celular foram caracterizados, contudo, não foi possível gerar um clone positivo (com o SNP) nos clones que analisamos até à data. Com este trabalho, foi possível otimizar a técnica de edição genómica por CRISPR/Cas9 nas duas linhas celulares utilizadas como modelo de estudo, implementando uma nova técnica no laboratório. Contudo, mais clones precisam de ser rastreados de forma a permitir uma melhor caracterização, aumentando, assim, a probabilidade de se conseguir um clone positivo para a condição SNP. Deste modo, permite-se um melhor estudo da reparação do corte pelo DNA dador por processos de recombinação homóloga.Ageing is associated with cognitive decline in both humans and animals. Among brain structures, those involved in memory, such as the hippocampus, appear to be particularly vulnerable to senescence and degeneration . Recently, a gene-based association analysis4 identified a single nucleotide polymorphism (SNP) in the gene ADORA2A, encoding for adenosine A2A receptor (A2AR) as significantly associated with hippocampal volume and cognitive deficits. The minor allele of rs9608282 in ADORA2A (rs9608282-T) is linked to larger hippocampal volumes and better memory. This polymorphism occurs in a non-coding region, upstream to the coding sequence and it was just suggested, but not studied, that this protective effect could be due to alterations in A2AR expression. We have shown recently14 that a significant overexpression of A2AR occurs in hippocampal neurons of aged humans, which is aggravated in Alzheimer’s Disease (AD) patients. A similar profile of A2AR overexpression in rats was viificientevii to drive age-like memory impairments in young animals and to uncover a shift in hippocampal synaptic plasticity. More importantly, the same plasticity shift was observed in memory-impaired APP/camp1 mice modelling AD, which was rescued upon A2AR blockade. In this project, we intended to explore the hypothesis that the above identified SNP inhibits A2AR expression. For that, we genetically manipulated the ADORA2A gene using a bacterial CRISPR-associated protein-9 nuclease (Cas9) from Streptococcus pyogene (CRISPR/Cas9) system for genome editing in two cell lines, human neuroglioma H4 cells (H4 cells) and human viific viificienteviiviima viificiente U2OS cells (U2OS cells), and quantified the output to A2AR expression. Both cell lines express detectable levels of A2AR mRNA and protein, therefore being both possible in vitro models to study the viificiente the rs9608282 SNP. The H4 and U2OS cells were submitted to CRISPR/Cas9-mediated HDR to insert the rs9608282-T SNP. We verified that DSB was induced by the Cas9, but unfortunately the efficiency of HDR might have been very low since we did not catch positive clones for the rs9608282-T SNP in any of the two cell lines. These results need to be further explored, namely by sequencing the remaining clones obtained and analyse the viificiente the SNP in the A2AR protein expression as compared to the WT sequence. This viificientevii shows that viificiente CRISPR/Cas9 with the designed gRNA could successfully create a DSB around the ADORA2A SNP representing an initial step for further attempts to incorporate this SNP to study its impact in A2AR expression.Rocha, Simão Teixeira daLopes, Luísa V.Repositório da Universidade de LisboaCosta, Raquel Lagoa Madruga da2024-04-08T00:31:25Z2021-04-082021-04-08T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/53885TID:202721868enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2025-03-17T14:48:14Zoai:repositorio.ulisboa.pt:10451/53885Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-29T03:25:14.242083Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
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