Estudo do tráfego nucleocitoplasmático do vírus da hepatite delta - FREITAS, Natália Maria Bezerra de (2009)
O vírus da hepatite delta (HDV) é o agente etiológico responsável pelas formas mais graves e mortais de doença viral hepática para as quais não existe uma terapia eficaz. O virião do HDV é formado por uma molécula de RNA circular e de cadeia simples associada a múltiplas cópias do antigénio delta e pelos antigénios de superfície do HBV (HBsAg). Os HBsAgs são glicoproteínas associadas ao reticulo endoplasmático das células e são indispensáveis para a montagem e empacotamento de partículas delta infecciosas capazes de infecção e transmissão. A replicação do genoma do HDV ocorre no núcleo das células por um mecanismo de círculo rolante, onde o RNA genómico do vírus serve de molde à síntese de moléculas multiméricas de RNA antigenómico, as quais possuem actividade ribozímica e se auto-clivam a intervalos precisos. Após clivagem, os antigenomas monoméricos religam-se e servem de molde à síntese de novas cadeias de RNA genómico por um mecanismo semelhante. Tanto o RNA como os HDAgs acumulam-se preferencialmente no núcleo das células. No entanto, a interacção das RNPs do HDV com os HBsAgs tem lugar exclusivamente no citoplasma. Foi demonstrado que as RNPs do HDV fazem um vai-vém contínuo entre o núcleo e o citoplasma e que a exportação nuclear das RNPs virais é um processo independente da presença de HBsAg, sendo mediado pelo RNA do HDV. O mecanismo oposto, ou seja, a importação das RNPs do HDV é um mecanismo mediado pelos antigénios delta que envolve o reconhecimento de sinais de localização nuclear pelas proteínas celulares especializadas no transporte nuclear através do poro nuclear.O presente trabalho teve como objectivo identificar os sinais presentes no RNA do HDV e nos HDAgs, e as proteínas celulares envolvidas no transporte núcleo-citoplasmático das RNPs do vírus. Com o objectivo de identificar os elementos de exportação nuclear presentes no RNA do HDV procedeu-se à construção e expressão de uma série de mutantes de deleção de um plasmídeo (pDL542) que codifica exclusivamente para o RNA genómico do vírus. Para a construção dos mutantes de deleção utilizou-se uma abordagem que se baseia na utilização da exonuclease III (Exo III). Os cDNAs do HDV com dimensões progressivamente menores, resultantes da digestão com a Exo III, foram clonados e utilizados para transfectar células Huh7. A identificação dos RNAs defectivos na exportação nuclear foi efectuada por comparação do padrão de distribuição intracelular de cada mutante de deleção com a localização do RNA genómico do HDV do tipo selvagem, através de experiências de hibridação in situ. A presença de sinais de exportação nuclear no RNA do HDV foi também estudada por quantificação dos níveis de expressão da proteína CAT em extractos de células transfectadas com o vector repórter pDM138, no qual foram inseridos vários fragmentos de cDNA que codificam para diferentes partes do RNA genómico e antigenómico do vírus. Como resultado da transcrição do vector repórter pDM138 são produzidos mRNAs que possuem a ORF da proteína CAT inserida numa região intrónica do genoma do HIV-1. A exportação e acumulação citoplasmática destes mRNAs depende da presença de sequências funcionais na exportação e está correlacionada com o aumento dos níveis da expressão da proteína CAT. Deste modo, a presença de um sinal de exportação numa sequência de RNA pode ser facilmente investigada por quantificação da proteína repórter CAT. O estudo da distribuição intracelular dos RNAs produzidos a partir dos mutantes de deleção do plasmídeo pDL542 não permitiu identificar nenhuma sequência no RNA genómico do vírus essencial para a exportação nuclear, uma vez que todos os mutantes de deleção do RNA genómico do HDV apresentam o mesmo padrão de distribuição intracelular do RNA genómico do tipo selvagem. No entanto, registou-se uma redução significativa no número de células transfectadas em que o RNA viral foi detectado no citoplasma, quando se analisaram as formas truncadas do RNA genómico sem as sequências compreendidas entre os nucleótidos 1211 e 1487, e 476 e 512. Os resultados dos ensaios de quantificação da expressão da proteína CAT após transfecção de células Huh7 com os vectores pDM138 que codificam para diferentes partes do RNA genómico do HDV mostraram a presença de três sequências no genoma do vírus capazes de causar um aumento na expressão da proteína CAT superior ao observado em células transfectadas com o vector pDM138 parental. Duas das sequências analisadas (nt 1191-1414 e 415-613) sobrepõem-se parcialmente com as regiões identificadas no genoma do HDV, na ausência das quais se observa uma redução significativa na percentagem de células com marcação citoplasmática. Em conjunto, estes resultados poderão indicar que o RNA genómico possui mais do que um elemento cis envolvido na exportação nuclear e que a eficiência do transporte do núcleo para o citoplasma está relacionada com o número de sinais de exportação presentes no genoma do vírus. A aplicação da mesma abordagem experimental para a pesquisa de sinais de exportação no antigenoma do HDV mostrou que este RNA viral possui um elemento cis, situado entre os nt 1263 a 1466, funcionalmente equivalente ao PRE do HBV. A actividade do sinal de exportação do antigenoma do HDV parece depender, da orientação da sequência identificada em relação à ORF da proteína CAT e da exportina CRM1. Demonstrou-se ainda, que o aumento da expressão da proteína repórter, induzido pela sequência compreendida entre os nt 1263 e 1466 do RNA antigenómico do HDV, resulta da exportação e acumulação citoplasmática de mRNAs repórter contendo a ORF da proteína CAT inserida no intrão. Estes ensaios foram conduzidos na ausência de replicação viral e consequente acumulação dos HDAg, sugerindo que os antigénios delta não são necessários para o transporte do RNA antigenómico do HDV do núcleo para o citoplasma. A análise funcional do elemento de exportação no transporte do RNA antigenómico para o citoplasma foi efectuada por comparação da distribuição intracelular do antigenoma do HDV com e sem o sinal de exportação nuclear. A redução de 60% na proporção de RNA no citoplasma em relação à quantidade de RNA antigenómico nas fracções nucleares, avaliada por qRT-PCR, mostra que o sinal de exportação situado entre os nt 1263 e 1466 altera a distribuição do antigenoma do HDV. Adicionalmente, utilizando uma abordagem similar demonstrou-se que os RNAs genómicos e antigenómicos do HDV, na ausência de replicação do vírus, são exportados em quantidades semelhantes. A abordagem utilizada para a identificação das sequências de aminoácidos do HDAg necessárias para a importação nuclear consistiu na expressão de diferentes subregiões do cDNA do HDAg clonadas na mesma grelha de leitura do gene da proteína repórter c-myc-PK que, na ausência de NLS funcionais, se acumula exclusivamente no citoplasma das células. Após análise detalhada dos aminoácidos do HDAg necessários e suficientes para promover a importação nuclear da proteína c-myc-PK confirmou-se a importância do NLS identificado na localização intracelular do HDAg nativo.Neste trabalho, obtiveram-se evidências sólidas que a importação nuclear do HDAg é dirigida por um único NLS, constituído por uma sequência contínua de 10 aminoácidos (EGAPPAKRAR), que se situam nas posições 66 a 75 na proteína. Esta sequência corresponde ao primeiro domínio do NLS bipartido anteriormente identificado no HDAg como sendo essencial para a importação nuclear de uma proteína repórter, diferindo apenas pela presença de um resíduo de ácido glutâmico adicional. Foi ainda demonstrado, que o NLS do HDAg não é específico para células hepáticas. As experiências de cromatografia de afinidade e de espectrometria de massa realizadas com o objectivo de identificar as proteínas celulares que interagem especificamente com o NLS do HDAg não permitiram elucidar o mecanismo pelo qual o antigénio delta é importado para o núcleo. Contudo, a identificação de proteínas de ligação a elementos do citoesqueleto poderá indicar o envolvimento desta estrutura no mecanismo de importação nuclear dos HDAg e das RNPs do HDV.