Interactor factors as suppressors of mutated mitochondrial tRNA - Carraco, Gil Daniel Bregieiro (2013)
Neste trabalho avaliou-se o efeito de mutações em tRNA mitocondrial humano usando a levedura Saccharomyces cerevisiae como modelo. Em termos genéricos S. cerevisiae é um microrganismo muito estudado e conhecido, sendo possível modificar o seu genoma de forma rápida e precisa. Como bom modelo permite estudar este tipo de doenças através da mutação dos seus genes que codificam para tRNAs através de um procedimento biobalístico. Com este procedimento é possível introduzir mutações nos genes que codificam para tRNAs mitocondriais da levedura em qualquer posição, incluindo mutações equivalentes às que são patogénicas em humanos. S. cerevisiae é também um bom modelo pois os seus mutantes que exibem deficiências respiratórias, complexas ou muitos graves, têm a capacidade de crescer pois continuam a realizar fermentação em glucose, permitindo assim efectuar estudos funcionais moleculares. Para além do referido, o uso de diferentes estirpes de S. cerevisiae com diferentes mutações permite estudar genes nucleares isolados capazes de suprimir o fenótipo anormal dos mutantes, neste caso o crescimento num meio respirável. Na primeira parte deste projecto caracterizaram-se três estirpes diferentes de S. cerevisiae wild-type, MCC123, D273-10B/1A e W303-1B e subsequentemente o efeito de substituições nos tRNAs mitocondriais com o propósito de definir uma relação entre a eficiência mitocondrial e a presença de diferentes contextos nucleares. Concluiu-se que as estirpes MCC123 e W303-1B são mais apropriadas para o estudo de mutações severas, em contraste a D273-10B/1A é mais adequada para estudar mutações mais leves. Na segunda parte estudou-se a actividade supressora da sobre-expressão dos genes que codificam para leucil-tRNA sintetase, o seu domínio C-terminal e algumas pequenas sequências em diferentes mutantes nos tRNAs incapazes de crescer em meios contendo glicerol (GlnC6T, AspC61T, GlyG30A e HisG51A). A tRNA sintetase inteira (genes de levedura e de humano) e o Cterminal têm alguma capacidade de suprimir o fenótipo anormal, mas o melhor resultado foi obtido sobre-expressando as sequências mais pequenas que codificam para péptidos de quinze aminoácidos do domínio C-terminal (β30-31 e β32-33). Outras sequências testadas não tiveram qualquer efeito supressivo. Também foi caracterizada a capacidade supressora dos factores de elongação da síntese proteica mitocondrial de levedura e humana em células carregando a mutação AspC61T. Os nossos resultados, sobre-expressando tRNA sintetases e factor EF-Tu, mostram que a capacidade catalítica não é necessária para a supressão e sugerimos que esteja envolvida uma catividade tipo chaperone.