The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas

Bibliographic Details
Main Author: Castro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de
Publication Date: 2012
Format: Master thesis
Language: eng
Source: Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
Download full: http://hdl.handle.net/1822/22719
Summary: Dissertação de mestrado em Genética Molecular
id RCAP_a62b6fb33ed50e5ccd744128d9b4d3bc
oai_identifier_str oai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/22719
network_acronym_str RCAP
network_name_str Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
repository_id_str https://opendoar.ac.uk/repository/7160
spelling The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas577.21616.348-006616.35-006Dissertação de mestrado em Genética MolecularColorectal carcinoma (CRC) is one of the most common types of cancer, leading to a high rate of mortality in Europe. Current therapies for CRC patients present poor outcomes, being mandatory new therapeutic approaches. Autophagy is an essential process for protein turn-over and cellular homeostasis being tightly implicated in cancer. This process has been described as fundamental in CRC cells chemoresistance emerging as a crucial target to anticancer therapy. One of the most frequent events found in CRC is the presence of activating mutations in KRAS (KRASG13D, KRASG12D and KRASG12V) which have a role in the genesis and progression of these tumours. Several studies have already demonstrated the importance of KRASG12V in autophagy induction either in fibroblasts and epithelial cells. However, little is known concerning the precise role of the different KRAS mutations in autophagy regulation in CRC cells. This project aimed to determine the role of KRAS mutations signalling in cellular survival/proliferation and autophagy regulation in CRC. For such purpose, a CRC derived cell line harbouring KRASG12V mutation (SW480) and a kidney derived cell line (HEK 293) stably expressing Flag-KRASWT, Flag-KRASG13D, Flag-KRASG12D, and Flag-KRASG12V were used as in vitro models. Downregulation of KRAS was performed by RNA interference (RNAi); the levels of autophagic markers were accessed by Western-blot analysis; cellular survival and proliferation were evaluated by cell cycle analysis and colony formation assay technique. Our preliminary results showed that in SW480 cells, upon KRAS inhibition by RNAi, there was a decrease in autophagic markers levels namely LC3 II, Atg5 and p62 as well as a decrease in ERK phosphorylation. Down-regulation of KRAS led to a decrease in S-phase and an increase of sub-G1 phase of the cell cycle. Moreover, treatment with the autophagy inhibitor, Bafilomycin A1, also led to an increase in cell death. In contrast, the results observed in HEK 293 cells do not support the obtained in SW480 cells, which might indicate that HEK 293 cells are not a suitable model to study the role of typical CRC KRAS mutations in autophagy regulation. Altogether the results indicate that KRASG12V protein may play a crucial role in autophagy regulation, survival and cell proliferation, possibly involving RAS–RAF–MEK–ERK signalling pathway, though further studies are required. The results also showed that CRC cells harbouring KRASG12V mutation seem to be dependent on autophagy for survival which can have important implications in CRC therapy.O carcinoma colo-rectal (CCR) é um dos tipos de cancro mais comuns, apresentando uma elevada taxa de mortalidade na Europa. Uma vez que as terapias para pacientes com CCR apresentam maus resultados, torna-se fundamental encontrar novas abordagens terapêuticas. A autofagia, um processo de renovação de proteínas e manutenção da homeostasia celular, tem sido descrita como fundamental na quimio-resistência das células do CCR, sendo um alvo importante para a terapia anti-cancro. A presença de mutações ativantes do KRAS (KRASG13D, KRASG12D e KRASG12V) é um dos eventos mais frequentes no CCR, estando implicada na sua formação e progressão. Inúmeros estudos demonstraram a importância do KRASG12V na indução da autofagia em fibroblastos bem como em células epiteliais. No entanto, o papel específico das diferentes mutações do KRAS na regulação da autofagia no CCR é ainda pouco claro. Este projeto teve como objetivo a determinação da função das mutações do KRAS na sobrevivência/proliferação celular bem como na regulação da autofagia no CCR. Para isso, uma linha celular derivada de CCR com a mutação KRASG12V (SW480) e uma linha celular derivada de rim (HEK 293) que expressa Flag-KRASWT, Flag-KRASG13D, Flag-KRASG12D e Flag-KRASG12V foram usadas como modelos in vitro. O silenciamento do KRAS foi conseguido através da técnica de RNA de interferência (RNAi); os níveis de expressão dos marcadores autofágicos foram analisados por “Western-blot”; a sobrevivência e proliferação celulares foram avaliadas por análise do ciclo celular e pela técnica de “colony formation assay”. Os nossos resultados preliminares mostraram que, nas células SW480, após inibição do KRAS, a expressão de LC3 II, Atg5 e p62 diminuiu, assim como a fosforilação das ERK. O silenciamento do KRAS levou a uma diminuição de células em fase S e um aumento em fase sub-G1 do ciclo celular. Além disso, o tratamento com um inibidor da autofagia, Bafilomicina A1, promoveu o aumento da morte celular. Os resultados observados nas células HEK 293 não estão de acordo com os obtidos nas células SW480, sugerindo que as células HEK 293 não são um bom modelo no estudo da regulação da autofagia pelas mutações do KRAS típicas do CCR. Os resultados indicam que o KRASG12V desempenha um papel fundamental na regulação da autofagia, sobrevivência e proliferação celulares, envolvendo possivelmente a via RAS–RAF– MEK–ERK, porém mais estudos são necessários. Os resultados demonstraram também que as células de CCR com a mutação KRASG12V parecem estar dependentes da autofagia para a sua sobrevivência, o que pode ter importantes implicações no tratamento dos CCR.Preto, AnaCastro, Maria Sofia Pinto Fernandes deUniversidade do MinhoCastro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de20122012-01-01T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/1822/22719enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiainstacron:RCAAP2024-05-11T07:33:50Zoai:repositorium.sdum.uminho.pt:1822/22719Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireinfo@rcaap.ptopendoar:https://opendoar.ac.uk/repository/71602025-05-28T16:31:34.329852Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologiafalse
dc.title.none.fl_str_mv The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
title The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
spellingShingle The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
Castro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de
577.21
616.348-006
616.35-006
title_short The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
title_full The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
title_fullStr The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
title_full_unstemmed The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
title_sort The role of KRAS mutations signalling in autophagy control in Colorectal Carcinomas
author Castro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de
author_facet Castro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Preto, Ana
Castro, Maria Sofia Pinto Fernandes de
Universidade do Minho
dc.contributor.author.fl_str_mv Castro, Paula Alexandra Martins Cosme Vieira de
dc.subject.por.fl_str_mv 577.21
616.348-006
616.35-006
topic 577.21
616.348-006
616.35-006
description Dissertação de mestrado em Genética Molecular
publishDate 2012
dc.date.none.fl_str_mv 2012
2012-01-01T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://hdl.handle.net/1822/22719
url http://hdl.handle.net/1822/22719
dc.language.iso.fl_str_mv eng
language eng
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
instname:FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia
instacron:RCAAP
instname_str FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia
instacron_str RCAAP
institution RCAAP
reponame_str Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
collection Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP)
repository.name.fl_str_mv Repositórios Científicos de Acesso Aberto de Portugal (RCAAP) - FCCN, serviços digitais da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia
repository.mail.fl_str_mv info@rcaap.pt
_version_ 1833595999857147904

Similar Items