Função da proteína Mob4/phocein na regulação da mitose - Gonçalves, Carolina Isabel Ramos (2022)
O funcionamento correto da divisão celular é essencial para que o material genético seja transmitido, de forma que uma célula progenitora dê origem a duas células filhas geneticamente idênticas, assegurando a continuidade da vida. No caso deste processo ser comprometido, poderão surgir várias complicações como por exemplo o aparecimento de cancro. Os nossos estudos iniciais indicam que o gene humano Mob4/phocein é essencial para a execução da mitose, mais concretamente para o correto alinhamento dos cromossomas na placa metafásica durante a mitose, sugerindo que mutações neste gene poderá ser um dos fatores causadores da instabilidade genómica observada em células cancerosas. No entanto o mecanismo molecular de acção da Mob4/phocein está ainda por definir. Pretende-se com este projeto determinar esse mecanismo. Para tal, o projeto iniciar-se-á com a criação de linhas celulares nulas para o Mob4/phocein, por CRISPR, e pela sua caracterização. Nestas linhas determinar-se-á de seguida a acumulação e atividade de proteínas centrossomais e do cinétocoro e analisar-se-ão os defeitos mitóticos resultantes da supressão completa do gene. Em simultâneo será analisado o fenótipo de linhas mutantes em peixe-zebra, nulas para o Mob4 e já criados por Marco Campinho do CCMAR. As técnicas a utilizar neste projeto incluem i) microscopia de células fixas, tanto por imunofluorescência como por análise de células a expressar proteínas marcadas com GFP e RFP; ii) supressão por CRISPR da expressão de genes em linhas celulares humanas (linhas tumorais e primárias); iii) transformação de células em cultura; iv) purificação e manipulação de ácidos nucleicos; v) expressão e purificação de proteínas. Com o desenvolvimento deste projeto foi possível verificar e concluir que a nível das linhas celulares humanas, o CRISPr foi um sucesso quer a nível molecular quer a nível proteico; não parece haver influência na concentração total da proteína com o estímulo célula; a nível da co-localização de Mob4 com o Golgi em Hct-11, esta não parece existir; e infelizmente, não temos degradação indutível da proteína Mob4. Aquando do trabalho realizado em Zebrafish, foi possível o isolamento de 11 animais F1 carriers. Com isto, é necessário determinar porque é que nas CRAL1 a Mob4-AID-GFP não tem degradação induzida por auxina e cruzar os animais carriers entre si, de forma a originar o mutante homozigótico nulo, e observar o seu fenótipo.